犬细粒棘球绦虫ediaga864单克隆抗体的制备及初步应用

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1、犬细粒棘球绦虫EdiagA864单克隆抗体的制备及初步应用ThemonoclonalantibodypreparationandapplicationofEdiagA864ofEchinococcusgranulosusindogs作者姓名：刘原源领域（方向）：兽医指导教师：张西臣教授类别：兽医硕士答辩日期：2015年6月6日本研究由国家公益性行业（农业）科研专项（201303042）资助。ThisworkwassupportedbyagrantfromtheSpecialFundforAgro-scientificResearchi

2、nthePublicInterestinChina(No.201303042).中文摘要犬细粒棘球绦虫EdiagA864单克隆抗体的制备及初步应用细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus)寄生在犬的小肠内，其感染性虫卵或者分泌的节片可随犬粪便排出体外，造成人和家畜的感染，严重威胁人类健康和畜牧业的快速发展，给世界经济造成了严重的损失。因此，此病的防治对人类健康和畜牧业发展非常重要。一直以来，各国研究者们努力探索用来快速诊断、控制并预防该病的有效措施及方法，虽然获得了很大的突破，但却从未从根本上阻止该病的流行。犬是该虫

3、的唯一终末宿主，因此犬细粒棘球绦虫的防治对控制此病的流行具有重要意义。目前，细粒棘球绦虫粪抗原的检测方法主要有槟榔碱导泻法、ELISA方法、PCR方法等，但是槟榔碱导泻法的反应率具有一定的局限性；ELISA方法常出现敏感性低，并伴有一定的交叉反应；PCR方法操作复杂，并对仪器要求较高。这些方法检测水平常常参差不齐，所用检测抗原也是包括成虫虫体抗原、囊液抗原、原头节虫体抗原及其分泌物抗原等许多种类。但至今还没有检测犬细粒棘球绦虫的金标准方法和抗原。因此，选择高特异性的抗原，建立具有高敏感性、高特异性的诊断方法十分必要。本研究利用抗细粒棘

4、球绦虫高免血清，筛选出细粒棘球绦虫的免疫相关抗原，经原核表达后制备了单克隆抗体和多克隆抗体，建立双抗夹心ELISA方法检测犬粪便抗原，为寻找有效的诊断抗原和建立高效、特异的诊断方法奠定了基础。细粒棘球绦虫相关抗原基因的筛选及原核表达本试验采用SEREX技术对细粒棘球绦虫cDNA文库进行相关抗原筛选。对文库λ噬菌体进行平板培养，用IPTG诱导其表达蛋白，用兔抗细粒棘球绦虫成虫高免血清、HRP标记的羊抗兔IgG对所表达的蛋白进行阳性筛选，共获得149个阳性噬菌斑，后对其插入片段进行PCR扩增和序列分析，得到与绦虫属相关的基因序列10个。其

5、中，具有864bp的开放性阅读框的序列，编码288个氨基酸，经NCBIBLAST氨基酸同源性分析与多房棘球绦虫诊断抗原gp50的氨基酸序列（CDJ06164.1）有92%同源性，是一个未知的新基因，本研究将其命名为：EdiagA864。对其成功构建克隆载体和表达载体，经原核表达得到大小约为51kDa的重组蛋白，经Westernblot分析其具有良好的反应原性。IEdiagA864蛋白单克隆抗体的制备与纯化以EdiagA864蛋白为抗原，经免疫Balb/c小鼠、细胞融合以及杂交瘤筛选与克隆，制备了共四株抗EdiagA864蛋白的单克隆抗

6、体，分别为2D12、3H4、4A6和6E5。经过染色体分析及抗体亚型的鉴定，得到2D12、3H4、4A6和6E5的细胞染色体数分别为97、101、98、96。4株单克隆抗体的重链亚型为为IgG1，轻链亚型为Kappa。2D12、3H4腹水效价为20万，4A6和6E5腹水效价为10万。经纯化后可见一条轻链与一条重链。EdiagA864蛋白多克隆抗体的制备与纯化以EdiagA864蛋白为抗原，经免疫日本大耳白兔，成功制备了兔抗EdiagA864多克隆抗体，经过Westernblot验证，该抗体能够特异性识别EdiagA864蛋白，并与弓形

7、虫、新孢子虫和犬心丝虫阳性血清均无交叉反应。犬细粒棘球绦虫双抗体夹心ELISA方法的建立本试验利用制备的单克隆抗体与兔多克隆抗体建立了三种双抗夹心ELISA方法：一是以单克隆抗体2D12作为捕获抗体，HRP标记的多克隆抗体作为检测抗体；二是以2D12和3H4两种单克隆抗体混合作为捕获抗体，HRP标记的多克隆抗体作为检测抗体；三是以单克隆抗体3H4作为捕获抗体，HRP标记的单克隆抗体2D12作为检测抗体。特异性试验中，三种方法与贾第虫阳性犬粪便样品、蛔虫阳性犬粪便样品均无交叉反应；敏感性试验中，方法一和方法二的敏感性为标准阳性样本稀释至

8、1:20，方法三的敏感性为标准阳性样本稀释至1:5。应用三种方法对细粒棘球绦虫阳性犬粪便样品进行了检测，方法一和方法二阳性检出率为100%（8/8），方法三的阳性检出率为87.5%（7/8）。应用三种双抗夹心ELISA方