牛囊胚icm转录组分析及体外培养

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1、分类号密级UDC单位代码10733甘肃农业大学硕士学位论文牛囊胚ICM转录组分析及体外培养TranscriptomeanalysisandinvitrocultureofICMderivedfrombovineblastocyst崔莉莎导师姓名:王宗礼研究员（甘肃农业大学兰州730070）指导教师姓名：马友记教授（甘肃农业大学兰州730070）朱化彬研究员（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193）学科专业名称动物遗传育种与繁殖研究方向动物繁殖技术论文答辩日期2015年5月26日学位授予日期2015年6月答辩委员会主席柳纪省研究员评阅人张兆旺教授杜卫

2、华副研究员2015年5月26日甘肃农业大学2015届硕士研究生学位论文TranscriptomeanalysisandinvitrocultureofICMderivedfrombovineblastocystByCuiLishaAThesisSubmittedToGansuAgriculturalUniversityinPartialFulfilmentoftheRequirementsForMasterDegreeSupervisor:WangZongliCo-supervisor:MaYoujiZhuHuabinCollegeofAnimalScien

3、ce&TechnologyGansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,P.RChina,730070InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgricuturalSciences,Beijing,P.RChina100193CommencementinJune,2015甘肃农业大学2015届硕士研究生学位论文本研究由中国农业科学院科技创新工程（项目编号ASTIP-IAS06-2015）;中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（项目编号2014ywf-yb-2）项目共同资助甘肃农业大学201

4、5届硕士研究生学位论文摘要牛胚胎干细胞（embryonicstemcells，ES）在畜牧业中具有重要的应用价值。但是目前，公认的牛ES细胞系仍未成功建立，其主要原因是牛ES细胞多能性维持机理尚不清楚。随着第二代测序技术（如Illumina，454和SOLID）的快速发展，RNA-Seq已成为研究基因表达和转录组分析新的重要手段。本试验利用RNA-seq筛选牛囊胚ICM和TE的差异表达基因并体外培养牛囊胚ICM克隆，旨在探究牛ES细胞多能性维持机制以及牛类ES细胞的多能性标记基因与表面标记，为优化牛类ES细胞培养条件和相关研究提供依据。试验一：基于RNA-S

5、eq技术的牛囊胚ICM与TE差异表达基因筛选本研究利用免疫磁珠分选和新一代高通量测序技术RNA-Seq，筛选牛囊胚ICM和TE之间的差异表达基因，并经qRT-PCR验证，进一步探索与维持牛胚胎干细胞多能性相关的特异基因、转录因子与细胞信号通路。试验中包括ICM和TE两个组，每个组包含三个重复，采用DESeq2分析测序数据，结果筛选出207个组间显著差异表达基因（Padj≤0.05并且

6、log2Ratio

7、≥1），其中159个基因在ICM中上调表达，48个基因在ICM中下调表达。筛选出14条显著富集于生物学过程的GO功能条目（P-value≤0.05），以及1

8、2条显著富集的Pathway（P-value≤0.05）。这些通路的功能涉及细胞命运的控制、细胞分化以及细胞多能性的维持和自我更新。试验二：牛囊胚ICM克隆的体外培养利用2i/LIF培养液，通过全胚接种及机械传代法分离与培养牛囊胚ICM；用免疫荧光染色法检测其多能性标记基因与表面标记；并通过qRT-PCR检测免疫磁珠法分选获得的牛囊胚ICM和TE的多能性标记基因的差异表达。试验成功分离出了牛囊胚ICM克隆，并体外培养至第10代。结果表明，ICM克隆表面标记SSEA1、SSEA4和TRA-1-60染色为阳性，且多能性标记基因OCT4、SOX2和NANOG在其中

9、均有表达；同时qRT-PCR结果显示SOX2在牛囊胚ICM和TE中的表达差异最为显著（P﹤0.01）。综上所述，2i/LIF培养液有助于牛囊胚ICM的培养；SOX2很有可能成为牛ICM克隆的候选多能性标记基因。关键词：差异基因；多能性标记;牛；ICM；RNA-seqI甘肃农业大学2015届硕士研究生学位论文SUMMARYBovineembryonicstem(ES)cellshavepotentialapplicationinlivestockindustry.ButnovalidatedbovineEScelllineshasbeengeneratedup

10、tonow，thismayprimarilybedu