斑点叉尾鮰il-8基因的克隆、表达及疫苗佐剂效应研究

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1、．ｗ分类号Ｓ９４２．５１学号：Ｓ２０２４４０６四川巧业大学佩Ｊｒ学位论文斑点叉尾触ＩＬ－８基因的克隆、表达及疫苗佐剂效应研究死波指导教师驾开統教授＇学科专业水产养殖研究方向鱼病与渔药／．＼２０１５年６月ＳｉｃｈｕａｎＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｇｙＭａｓｔｅｒＤｅｒｅｅＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｇＣｌｏｎｉｎＥｘｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＥｆｆｅｃｔｓｏｆＶａｃｃｉｎｅｇ，ｐＡｄｕｖａｎｔｏｆ／ｃ伯／ｗｗ妨ＣｈａｎｎｅｌＣａｔｆｉｓｈｊＩＬ－８ＢＬｏｎＢｏｙｇ

2、ＤｉｒｅｃｔｅｄｂｙＰｒｏｆ．ＷａｎｇＫａｉｙｕＡｕａｃｕｌｔｕｒｅｑＣｏｌｌｅｇｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｉｃｈ朋ｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＣｈｅｎｄｕＳｉｃｈｕａｎ，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａｇ，Ｊｕｎｅ２０１５，论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加＾处标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研巧成果，也不包含为获得四川农业大学一或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我同工作

3、的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名；兴护年《月八曰关于论文使用授权的声明、目Ｐ本人完全了解四川农业大学有关保留使用学位论文的规定，；学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可＾＾＾采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可Ｗ用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。囚；＾：论文不保密。□本论文保密，在密后适用本授权。＿＿年解＂＂（请在Ｗ上□内划Ｖ）研究生签名：方任年《月八曰导师签名：勢化年《月《曰如Ｘ／

4、ｆｆ－８基因的克隆斑点叉尾細ＩＬ、表迭及疫苗佐剂效应研究摘要渔用疫苗接种因其可有效地预防水产动物疾病，又能避免抗生素等药物对水环境和水产品本身造成的污染，已成为国际上水产疫病防控的主流技术。免疫佐剂是指结构多样具有调节疫苗抗原固有免疫原性属性的物质。细胞因子是机体的自身成分，作。ＩＬ－８为佐剂，相比传统佐剂具有更多优势是由多种细胞产生具有庭化属性的细胞因－子，它能促进局部的炎症反应，趋化Ｔ细胞和调节其细胞因子的产生。研究表明，正８。作为细胞因子佐剂对疫苗具有免疫増强作用，可显著增强疫苗的免疫保护效力本文Ｗ斑点叉尾娜源正－８作为细胞因子佐剂来验证其能否増

5、强斑点叉尾細源海豚链球菌疫苗的免疫效力。具体内容包括：１斑点叉尾細ＩＬ－８墓因的克隆及分子檐性分析民Ｔ－ＰＣＲ法正－８－８）－８采用从斑点叉尾細脾脏中扩增出（Ｃｃ正基因，并将Ｃｃ圧ＭＤ巧－Ｔ。片段克隆到ｐ载体中，构建重组质粒应用生物信息学工具对该基因的核巧。－８３３６ｂ酸序列及其推导的氨基酸序列进行分子持性分析结果表明；Ｃｃ圧全长ｐ，包含一个完整的开放阅读框，编码１１１个氨基酸，含有ＣＸＣ型趋化因子保守结构域和信号狀－；存在跨膜区；含有２个潜在的丝氨酸磯酸化位点和２个潜在的Ｎ糖基化－二－位点；级结构主要由ａ螺旋和Ｐ折叠组成；気基酸序列分析表明本研究

6、得到的是ＩＬ－８成妃）比－８斑点叉尾娜短的可变转录本，该氨基酸与印度裹飯餘（巧ｐｎｅｗｔｅｓ於Ｍ一一氨基酸的致性高达８７．１％，进化树上聚为簇，亲缘关系较近，与趣鱼、斑马鱼和虹縛等硬骨鱼类亲缘关系较远。２斑点叉尾細－８ＩＬ成熟肤基因的原核表达及其作为海豚链球菌亚单位疫苗免疫佐剂的效果评价ｃＩＬ－８参照已克隆的Ｃ序列设计去信号狀引物，克隆到斑点叉尾細成熟狀＇。正－）基－＋（１１１８因，全长２６４６９。将成熟肤基因与口６１３２＆载体连豁构建原核表（）ＥＴ－３２ａ＋－－８ＢＬ２１ＤＥ３达载体ｐ（）ｍＣｃ正，并于表达菌（）中诱导表达，成功表达大小约为巧

7、ｋＤａ的重组斑点叉尾細正－８Ｃ－８。经过Ｎ－ＮＴＡ亲和层析成熟（重姐ｍｃ正）蛋白ｉＩＷ－纯化＾１＞及梯度透析复性后，ｅｓｔｅｍｂｌｏｔ和８０８壬乂０５１检测分别表明重组蛋白融合表一。ＣｄＬ８Ｃｃ＾－８达成功Ｗ及该蛋白己纯化为单条带为验证纯化复性的重组ｍ（ｒｍ）－（：２０ｌ／蛋白是否具有免疫佐剂效应，将重组〇１〇正８蛋白（尾）与海豚链球茜亚单位＾ｇ＆扔的ｅ－ｒＥＮＯ／疫苗（５０惦尾）混合腹腔注射免疫斑点叉尾娜（８化ｌＯｇ），同时ｌｉｌ