一株含新裂解酶的大肠杆菌噬菌体基因组测序及其裂解酶的活性检测

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1、一株含新裂解酶的大肠杆菌噬菌体基因组测序及其裂解酶的活性检测GenomesequencingofanEscherichiacolibacteriophagewithnovellysinandactivitydetectionofitslysin作者姓名：吕萌专业名称：预防兽医学指导教师：雷连成教授学位类别：农学硕士答辩日期：2015年6月6日本研究受国家重点基础研究发展计划（2013CB127205）项目资助ThisstudywassupportedbygrantsfromtheNationalKeyBasicResearchPr

2、ogramofChina(No.2013CB127205).摘要一株含新裂解酶的大肠杆菌噬菌体基因组测序及其裂解酶的活性检测近年来日渐严重细菌抗生素耐药问题，已对人类健康和畜牧业发展造成了极大威胁。面对耐药菌不断的增多和耐药基因的广泛传播，噬菌体及其裂解酶再次成为人们的研究热点。噬菌体及裂解酶相关分子，在抗菌治疗方面具有抗生素无法比拟的优越性。为了提高药用噬菌体及裂解酶的安全性，不仅要分析它们的生物学特征，还要从基因水平分析它们的进化及是否含有有害基因，对于革兰氏阴性菌噬菌体的裂解酶更要研究从细胞外直接裂解细菌的方法，提高使用的方

3、便性。本研究从自然界的污水分离到一株噬菌体vB_EcoM-ep3，并研究各项生物学特性：它的最佳MOI在0.1~0.001之间；具有良好的热稳定性，50℃以下，2小时内可以基本保持其原活性；潜伏期为20min，裂解期约40min，能裂解大肠杆菌O78及8株临床分离的鸡大肠杆菌；透射电镜观察结果显示vB_EcoM-ep3形态学上属于肌尾噬菌体科，由此判断它是一株裂解性较强、裂解谱广的噬菌体。因此对其进行全基因组测序，软件预测、注释分析各个开放阅读框的功能，从基因组水平研究噬菌体的进化关系，由42351个核苷酸组成，GC含量为53.3

4、5%，52（48.1%）个ORF具有假定功能，与噬菌体vB_EcoM_ECO1230-10同源性很高。分析发现裂解酶Lysep3在基因水平上没有任何相似性，蛋白水平上与假单胞菌PPpW-3裂解酶具有较高相似性，达到58%。原核表达噬菌体裂解酶Lysep3，联合EDTA、柠檬酸和苹果酸能有效的裂解绿脓杆菌ATCC27853以及大肠杆菌DH5α，在蛋白浓度为3mg/mL、1.5mg/mL和0.75mg/mL时，2h分别降低细菌数量约5倍、4.7倍和2.1倍；3mg/mL和1.5mg/mL时，作用24h更能使细菌量降低两个数量级；为了使

5、裂解酶能直接裂解细菌，构建了重组裂解酶Lysep3-D8，对大肠杆菌O78有极为明显的裂解活性。且裂解活性对酶浓度呈依赖性。通过以上实验结果可得出结论：噬菌体vB_EcoM-ep3具有良好的裂解性能及生物学稳定性，其裂解酶与假单胞菌PPpW-3裂解酶具有较高同源性，且在EDTA、柠檬酸和苹果酸的协同下能有效的裂解细菌，改造的融合裂解酶更能直III接裂解细菌，具有潜在的药用价值。关键词噬菌体，基因组分析，裂解酶，重组裂解酶，裂解活性IVAbstractGenomesequencingofanEscherichiacolibacter

6、iophagewithnovellysinandactivitydetectionofitslysinInrecentyears,theproblemofbacterialresistancehascausedagreatthreattohumanhealthandanimalhusbandry.Facedwithresistantbacteriaincreasingandresistancegenesdisseminatingbroader,phageandlysinhavecaughtresearchers’attention

7、again.Inantibacterialtreatment,bacteriophagesandlysinhavemoreadvantagesthanantibiotics.Wemustanalyzenotonlytheirbiologicalcharacteristics,butalsotheirevolutionandharmfulgenesfromgeneticlevelforthesafetyofbacteriophageandlysintherapy.Whenitcomestotheuseofgram-negativeb

8、acteriaphagelysin,weneedtoconsidertheextracellularbacteriallysis.vB_EcoM-ep3wasisolatedfromdomesticsewageandthenstudyitsbiol