灵芝全局性调控基因laea的克隆及其在灵芝酸生物合成过程中的差异表达

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4、芝酸的积累与灵芝抱子的形成息息相关，。在丝状真菌中全局性调控因子么７６＾不仅能够调控菌丝分化，还对多种次级代谢基因簇的表达和次级代谢产物的产生起到重要的调节作用，因此推测基因在灵芝酸的合成过程中同样具有全局调控的功能。然而迄今为止，灵芝的基因尚未见报道。本实验利用灵芝较完整的表达序列标签（ＥＳＴ）数据库，己知枯青霉＇（化／！切侃化如ＭＷ）的ＬａｅＡ蛋白质序列为模板，通过序列相似性搜索，序列拼接，序列验证和序列延伸等电子克隆手段获得灵芝的ｃＤＮＡ序列。经ＰＣＲ和测序验证，该基因ｃＤＮＡ全长＾３７ｂｐ，与其他真菌Ｉａｅ＾基因

5、具有较高的同源性。在此ｃＤＮＡ的基础上，从灵芝基因组数据库定位获得王完整基因，该基因包含７个外显子Ｗ及６个内含子，有真核基因后动子元件ＴＡＴＡ盒、增强子结合区域ＣＣＡＡＴ和ＧＣ框。采用生物信息学方法，借助电子计算机和相关的生物信息学软件，对该基因所编码里．白从基本理化性质，疏水性／亲水性、亚细胞定位、跨膜区结构、信号化、二级结构、３７８兰级结构及进化关系等方面进斤了预测和分析。该ｃＤＮＡ编码蛋白有个氨基酸，４２一相对分子质量为８９５．３Ｄａ，理论円值为７．４５，是亲水性蛋白，存在于细胞质中。Ｓ－ＳＡＭ）含有腺巧甲硫氨酸

6、（结合位点，并且含有典型的ＷＳＡＭ为底物的甲基转移酶超家族结构域，因此可确定该ＬａｅＡ蛋白行使甲基转移酶的功能。该蛋白与云芝、污义丝孔菌等白腐担子菌类的亲缘关系较为亲近。为了进一ｅ／步研巧灵芝心ｌ蛋白的性质，将基因与质粒ｐＥＴ３２ａ连接，并转化到大肠杆蘭中，成功构建了灵芝基因大肠杆菌异源表达体系，经ＰＴＧＩ诱导该基因在大肠杆苗中得到初步表达，为今后的蛋白纯化及蛋白性质研究奠定基础。振荡培养和液体静置培养是灵芝发酵生产贡芝酸的两种重耍培养方式。本实验分别通过反相ＨＰＬＣ和巧光定量ＰＣＲ法分析了灵芝在两种不同发酵过程中灵芝酸

7、的产量和基因的表达差异。数据显示灵芝细胞在液体静置培养条件下灵芝酸的产量高于振荡培养方法，宜畏芝酸的产量与心基因的转录水平呈现正相关。灵芝全局性调控因乎的发现为通过基因操作研究灵芝酸的生物合成调控机制奠定了基閒Ｉ。Ｉ？福建师范大学贺望兴硕±学位论文，，液体静置培养，全局性调控因子，心ｅ儿巧光定量ＰＣＲ关键词：灵芝灵芝酸ＩＩＡｂｓｔｒａｃｔＡＪｂｓｔｒａｃｔ＇ｍＧａｎｏｄｅｉａｉｓｏｎｅｋｉｎｄｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｄｉｃｉｎｅｉｎＣｈｉｎａｍｏ过ｅｍｍｅｄｉｃａｌｒｅｓｅａ

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