独活寄生汤对小鼠软骨细胞Zinc-ZIP8-MTF1轴的调控作用研究

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1、成都中医药大学（临床医学院）二0一八届硕士研究生学位论文独活寄生汤对小鼠软骨细胞Zinc-ZIP8-MTF1轴的调控作用研究TheregulationeffectofDuhuojishengDecoctiononZinc-ZIP8-MTF1axisinmicecartilagecell研究生姓名：侯朝铭指导教师：朱明双教授学科专业：中医骨伤科学二○一八年六月学位论文独活寄生汤对小鼠软骨细胞Zinc-ZIP8-MTF1轴的调控作用研究TheregulationeffectofDuhuojishengDecoctiononZinc-

2、ZIP8-MTF1axisinmicecartilagecell(侯朝铭)指导教师姓名：朱明双申请学位级别：硕士专业名称：中医骨伤科学论文提交时间：2018年3月15日论文答辩时间：2018年5月24日二○一八年六月1.论文用A4纸打印，严格按打印格式给出的字型字号，如正文用小4号或4号宋体，通栏排列，标题用黑体，同级标题字体字号必须一致，不同级标题字号应有区别，如一级标题用二号黑体，二级标题用三号黑体，三级标题用四号黑体，以此类推，标题与正文之间空行不得小于一行｡2.图表应编排序号，应轮廓分明､清晰可见｡3.文献综述可附录在学

3、位论文正文后或单独成册｡4.论文电子版一律以PDF格式交到相关学院及校学位办备份｡中文摘要目的：通过独活寄生汤含药血清对小鼠软骨细胞Zinc-ZIP8-MTF1轴的调控作用研究，探寻独活寄生汤治疗膝骨关节炎（KneeOsteoarthritis，KOA）的作用靶点及作用规律，揭示其治疗机制。为临床独活寄生汤治疗膝骨关节炎（KneeOsteoarthritis，KOA）提供可靠的实验依据。方法：将20只SD大鼠随机分为2组：空白对照组、实验组，每组10只。独活寄生汤按临床等效剂量的10倍灌胃给药，空白对照组给予生理盐水，按1mL/

4、100g体重灌胃。每天上午、下午各1次，连续3天，末次给药1小时后，腹主动脉取血，离心分离血清，56℃水浴30min灭活，分装，-80℃冻存，独活寄生汤含药血清备用，采用表达Zip8的腺病毒感染Ad-Zip8（VectorBiolabs）感染小鼠软骨细胞，感染复数为800MOI，感染时间为2小时，继续培养24小时构建Zip8过表达细胞模型用于实验。排除中药多靶点效应的干扰，采用siRNA靶向沉默Zip8的表达构建Zip8-siRNA基因沉默细胞模型用于实验。将细胞随机分为：空白对照组（Control）、模型对照组（Model/Z

5、nCl2）、Ad-Zip8组（Ad-Zip8）、Zip8-siRNA组（Zip8-siRNA）、低剂量组（2.5%DHJST）､中剂量组（5%DHJST）､高剂量组（10%DHJST），每组设3个复孔，分组后，培养体系内加入1ng/mLIL-1β；培养24小时后，加入100uMZnCl2，同时给予含药血清干预；分别采用10%、5%、2.5%（v/v）的含药血清作为高、中、低剂量组（含药血清不足10%的剂量组，给予相应体积正常大鼠血清补足10%）；10%正常大鼠血清作为对照组。继续培养48小时后采用荧光染色技术检测软2+骨细胞内Z

6、n浓度，提取细胞总RNA，去除gDNA，合成cDNA，采用qRT-PCR检测软骨细胞ZIP8,ZNT9,MTF1,Mt1，Mt2基因的表达，采用蛋白质免疫印迹法（WesternBlot）结合图像分析ZIP8,ZNT9,MTF1,Mt1，Mt2蛋白表达。结果：2+1.软骨细胞在IL-1β诱导的炎症状态下，细胞内Zn浓度明显增2+加，加入独活寄生汤含药血清（DHJST）后对Zn浓度有一定的影响，2+由图中染色显像可见含药血清低剂量组Zn浓度降低，染色部分减少，2+2+5%的含药血清中剂量组Zn浓度次之，10%的的含药血清高剂量组Zn

7、2+浓度最低，由此可见独活寄生汤含药血清（DHJST）浓度越高，Zn的浓度越低，染色显像部分越少，颜色越淡，独活寄生汤含药血清2+（DHJST）对Ad-Zip8过表达细胞模型内的Zn浓度有一定降低作用。独活寄生汤含药血清（DHJST）对Zip8-siRNA基因沉默细胞模型内的2+Zn浓度有一定降低作用。综上所述，独活寄生汤含药血清（DHJST）2+对细胞内Zn浓度有一定的抑制作用，独活寄生汤含药血清（DHJST）2+2+含量越高，细胞内Zn浓度越低，反之，细胞内Zn浓度越高，故独2+活寄生汤含药血清（DHJST）可降低炎性状态的

8、软骨细胞内Zn浓度。2.根据RT-qPCR检测结果显示，独活寄生汤含药血清对Zip8mRNA表达水平具有明显抑制作用，但其作用强度不及Zip8-siRNA。同时也发现，独活寄生汤含药血清无法对抗Ad-Zip8引发的Zip8mRNA过表达,独活寄生汤含药血清对高锌