口蹄疫—水疱性口炎—猪水疱病联合共检基因芯片的构建

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1、Ｉ—ｒ、■；；，分类号Ｓ化２．巧９学号￥２０１２巧２７四川农化大学硕ｄｔ学位论文口蹄疫－水瘤牲口炎－猪水疮病联合共检基因怒片的构建欧阳达指导教师文也田巧巧学科专业预防咎睽挙研巧方向畜禽传染病２０１５年６月Ｃｌａｓｓｔｂｅ２．６５９ＳｔｔｂｅＳ２０１２巧２７ｉｆｉｃａｉｏｎＮｕｍｒ：Ｓ８５ｕｄｅｎＮｕｍｒ：ＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮＳｕｂｍｉｔｔｅｄｉｎＰａｒｔｉａｌＦｕｌｆｉｌｌｍｅｎｔｏｆｔｈｅＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｆｏ「

2、ＭＡＳＴＥＲＤＥＧＲＥＥ－－ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＦＭＤＶＶＳＶＳＶＤＶＭｉｃｒｏａｒｒａｙＢＤａＯｕａｎｙｙｇＤｉｒｅｃｔｅｄｂｙＰｒｏｆ．ＸｉｎｔｉａｎＷｅｎ＇ＹａａｎＳｉｃｈｕａｎ６２５０１４Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ，，，Ｊｕｎｅ０１５，２论文独倒性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料一。与我同工作的同

3、志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：旬月曰淡梦巧年＾／７关于论文使用授巧的声明目Ｐ；本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，光许论文被查阀和借阅，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可Ｗ用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。论文不保密。□本论文保密。，在＿＿年解密后适用本授权＂＂（请在Ｗ上□内划Ｖ）研究生签名；哈於年店月＾曰卿导师签名：户年月日＾摘要曰蹄疫口口ｏｏｔ

4、－ａｎｄ－ｍｏｕ化化ｅａｓｅ、猪水疮病和水疮性炎分别是由蹄疫病毒（Ｆｖｉｎｊｓ，ＦＭＤＶ）、猪水疮病病毒（Ｓｗｉｎｅｖｅｓｉｃｕｌａｒｄｉｓｅａ化ｖｉｒｕｓ，ＳＶＤＶ）和水疮性口炎病毒‘（Ｖｅｓｉｃｕｒｌａｓｔｏｍａｔｒｔｉｓｖｉｍｓ，ＶＳＶ）弓胞的急，都可Ｗ感染猪性动物传染病，且由于发病一，从发病症状上鉴别难度较大症状相似，因此构建种能同时鉴别诊断Ｈ种疾病和区分口蹄疫Ｈ种血清型的髙通量联合检测方法具有重要意义。本研究ＷＦＭＤＶＯ型、Ａ型、Ａｓｉａ１ＳＶＤＶ为研究对象型、ＶＳＶ和，建立了寡核巧酸基因芯片检测体系。研究内容如下；１．共检基因苍片的帮基因引

5、物和探针的构建：参考ＧｅｎＢａｎｋ中已公布的基因组序列，根据基因芯片引物设计要求，选拝三种病毒的保守区域设计引物和探针，对引物和探针进行了验证，构建了基于口蹄疫病毒ＡＭＤ－的、０、Ａｓｉａｌ型ＶＰ１序列、ＶＳＶ的Ｌ基因和ＳＶＤＶＶＰ１序列的ｐ：Ｌ９Ｔ克隆质粒并一测序整定。结果显示Ｉ９５％Ｗ上。，克隆的郎基因与ＮＣＢ公布的序列致性均在２．共检基因芯片的构建和优化设计了基因芯片矩阵和位置指控、杂交质控及杂交质控探针序列，并对Ｈ种病毒的探针进行了筛选。对蓝片点样后的水化温度与封巧条件、ＰＣＲ退火温度和循环数、、。巧光基团标记引物的使用量杂交湿度等进行了优化结果表

6、明：使用醒基基片，在’°１８Ｃ－３７Ｃ水化过０．２５％ＢＨＮａ２５％己醇的封闭私使用含４，液进行封闭所制的芯片效‘果较好ＰＣＲ５８Ｃ一２３０，叫巧光基团标记引物；扩增时选择退火温度般使用，扩增个循环便可得到足够的产物４－８；在临床检测时为提高灵敏度可使用叫巧光基团标记－引物－５０４２Ｃ，扩増４０个循环，杂交温度达到便可获得有意义的结果，为保证特异性，在°Ｃ进５２行杂交效果更好。３．共检基因芯片的效果评价对所构建的基因苍片检测方法进行了灵敏性试验、特异性试验、重复性试验和稳定性试验ＦＭＤＶ－０ＰＣＲ化１１８０ｎｍＬ。结果表明，本研究所设计的引物检测限为ｇ／，

7、－Ａ００１８４ｎｍＬＦＭＤＶ－ＡＦＭＤＶ为ｉ２９ｎｌ＿ＶＳＶ０２６７ｎＶＤＶ．ｓａＩ为０．１ｇ／ｍ，为．０ＬＳｇ／ｇ／ｍ，为化０一２４７ｎｇ／ｍＵ芯片检测方法灵敏度至少比ＰＣＲ检测高个数量级；特异性良好，所设计引物没有出现非特异性扩增，能准确区分检测出ＦＭＤＶ、ＶＳＶ、ＳＶＤＶ，并能区分Ｉ出日蹄疫病毒的Ｈ种血清型；应用了两家公司所生产的不同批次酸基基片进行重复性验证°Ｃ，均能够较好地实现重复