六价铬诱发干细胞dna损伤的机理研究

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1、分类号：S813.3学校代码：10712UDC：599.32～599.89研究生学号：2010060150密级：公开2015届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文六价铬诱发干细胞DNA损伤的机理研究学科专业动物遗传育种与繁殖研究方向生物技术与动物育种研究生吕英华指导教师曾文先教授完成时间2015年5月27日中国陕西杨凌Classificationcode:S813.3Universitycode:10712UDC:599.32～599.89Postgraduatenumber:2010060150Confidentialitylevel:PublicDissertationforD

2、octorDegreeNorthwestA＆FUniversityin2015MECHNISMOFDNADAMAGERESPONSESINSTEMCELLSINDUCEDBYCHROMIUM(VI)COMPOUNDSMajor:AnimalBreedingandReproductionResearchfield:BiotechnologyandAnimalBreedingNameofPostgraduate:LVYingHuaAdviser:Prof.ZengWenxianDateofsubmitted:May27,2015YanglingShaanxiChina本研究由国家自然

3、科学基金面上项目（31272439），国家自然科学基金重点项目（31230048），国家重点基础研究发展计划（973计划）项目课题（2014CB943102）共同资助完成六价铬诱发干细胞DNA损伤的机理研究摘要诱导多能干细胞（inducedPluripotentStemCells，iPSCs）来源于基因组重编程后的体细胞，能够自我更新并具有分化成多种细胞类型的潜能。iPS细胞作为胚胎干细胞重要的替代物已经应用于药物研发，体外扩增和血细胞谱系的细胞分化等方面。鉴于iPS细胞在人类疾病模型和再生医学研究的潜在价值，有必要了解其生物学特性，尤其是当细胞暴露于环境基因组毒性物质时，了解这

4、些细胞如何保护基因组稳定性是非常重要的。精原干细胞（SpermatogonialStemCells，SSCs）起源于胚胎发育过程中的原始生殖细胞（PrimordialGermCells，PGCs），是精子发生的祖细胞，具有自我更新和定向分化的潜能，可进行体外培养、冷冻保存和体外移植，在医学和生物学及动物科学方面均有广阔的应用前景。精原干细胞作为一种独特的能够将亲代遗传信息传递给下一代的成体干细胞，其分化能力由自身及其所处的生理、环境条件所决定。当环境条件不适时，精原干细胞就会停止分化，从而影响精子发生，导致雄性生殖机能的异常。六价铬是一种环境致癌物，能产生基因组毒性而导致人类罹患

5、癌症。虽然在终末分化的体细胞中已有研究报道六价铬的毒性与致癌性，但是六价铬在iPS细胞和精原干细胞中的基因组毒性作用及其机制尚未见报道。因此，本研究以六价铬为基因组毒性试剂，双氧水H2O2和阿霉素(Doxorubicin，DOX)为平行对照，检测干细胞中DNA损伤反应信号通路中关键分子元件的激活，包括ATMser1981，H2AXs139，p53ser15，p53ser20和p53ser392的表达情况。结果显示，六价铬在iPS细胞等干细胞具有独特的DNA损伤反应作用机制。主要结果如下：（1）iPS细胞经六价铬处理后，ATMser1981的磷酸化表现出独特的双相表达模式；0～1h

6、ATM磷酸化出现，1～24hATM磷酸化消失，24h～48hATM磷酸化再次出现。（2）本研究以双氧水（H2O2）和阿霉素(Doxorubicin，DOX)这两种典型的可因氧化应激作用而造成DNA损伤的基因组毒性物质做为诱发因子的平行对照。结果显示，在iPS细胞六价铬与双氧水一样，均引起ATMser1981的磷酸化呈现相同的双相诱发趋势，表明六价铬诱发的DNA损伤机理可以认为是氧化应激引起的DNA损伤，从而导致的基因组不稳定。（3）依赖于p53的DNA损伤调控通路是细胞应对DNA损伤的天然防护屏障。在正常的情况下，细胞中p53蛋白是被下调的。在三种基因组毒性诱发因子的作用下，在i

7、PS细胞检测到p53ser15和p53ser392的磷酸化，但未检测到p53ser20的磷酸化，说明p53ser20不参与iPS细胞中DNA损伤信号通路的调控。（4）在体细胞的研究表明p38，Casinekinase2（CK2）调控p53在ser392位点的磷酸化。本研究采用p38MAPK抑制剂（SB203580）和CK2抑制剂（TBBz）分别作用于iPS细胞，检测iPS细胞在基因组毒性物质处理后p53ser392磷酸化状态，研究p38和CK2是否协同或彼此独立参与调控iPS细胞