α-细辛醚开启斑马鱼血脑屏障作用机制及其生物安全性的研究

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1、分类号Ｓ８５１．３靴鶴１０１３６ＩＣＳ学号２０１２００１２３。＂呈畫畫Ｃ［々篆古氏斋大等硕ｄｒ学位论义ａ－细辛雖开启斑马鱼血脑屏障作用机制及其生物安全性的研究ｔｕｄｏｎｔｈｅＭｅｃｈａｎ－－ＳｙｉｓｍｏｆａａｓａｒｏｎｅＲｅｕｌａｔｉｏｎＢｌｏｏｄＢｒａｉｎｇＢａｒｒｉｅｒａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳａｆｅｔｙｉｎＺｅｂｒａｆｉｓｈ申请人：尚艳楠＿＿二一学科专业：预巧兽医学；苗研究方向：畜禽传染病发病机制及防治技术硏究学位类别：学术学位指导教师：马德慧教授—论文

2、提交日期：二０五年Ｈ月内蒙古民族大学硕±学位论文作者声明本人声明：本人呈交的学位论文是本人在导师指导下取得的研巧成果。对前人及其他人员对本论文的启发和贡献己在论文中做出了。明确的声明，并表示了感谢论文中除了特别加臥标注和致谢的地方夕ｈ不包含其他人己经发表或撰写的研究成果。．本人同意内蒙古民族大学保留并向国家有关部ｎ或资料库送交学位论文或电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权内蒙古民族大学可将本人学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。ｒ《月作者签名：知期：心年日

3、Ｊ分类号S851.3学校代码10136ICS学号201200123硕士学位论文α-细辛醚开启斑马鱼血脑屏障作用机制及其生物安全性的研究StudyontheMechanismofα-asaroneRegulationBlood-BrainBarrierandBiologicalSafetyinZebrafish申请人：尚艳楠学科专业:预防兽医学研究方向：畜禽传染病发病机制及防治技术研究学位类别：学术学位指导教师：马德慧教授论文提交日期：二○一五年三月摘要本文主要研究α-细辛醚对斑马鱼血脑屏障（Bloodbrainbarrier,BBB）结构及紧密连接蛋白家族

4、Claudin、occludin、ZO、JAM基因表达的影响，以阐明α-细辛醚开启血脑屏障的作用机制，并对α-细辛醚的生物安全性进行评价，主要对斑马鱼的生殖毒性和胚胎发育毒性进行研究，为人畜临床应用α-细辛醚奠定理论基础。采用的方法主要利用心脏注射方式将大分子荧光物质DextranTexasRed注入斑马鱼幼鱼心脏，之后将其浸泡在α-细辛醚溶液中，利用共聚焦显微镜观察α-细辛醚是否能帮助大分子荧光物质通过血脑屏障进入脑内；成年斑马鱼通过腹腔注射方式给予α-细辛醚后，利用透射电镜观察α-细辛醚作用斑马鱼成鱼后，斑马鱼血脑屏障超微结构的变化；利用脑组织切片HE染色

5、，显微镜观察斑马鱼脑组织结构的影响；利用实时荧光定量PCR（Real-timequantitative,RT-qPCR）来研究α-细辛醚对斑马鱼紧密连接蛋白家族Claudin、ZO、occludin、JAM基因表达及时效性的影响；α-细辛醚的生物安全性胚胎发育毒性，取受精后3h（Hourspost-ferilization，hpf）的斑马鱼胚胎放入不同浓度梯度的α-细辛醚溶液中暴露，分别观察暴露在α-细辛醚在24hpf，48hpf，72hpf，96hpf不同时间点胚胎发育的形态现象，统计斑马鱼胚胎自主抽动的频率、孵化率、心率、畸形率及死亡率等指标的变化，包括心

6、包的水肿、脊柱的弯曲、尾巴的弯曲、卵黄囊水肿等现象；利用RT-qPCR方法来检测斑马鱼浸泡α-细辛醚96hpf后对sepn1基因表达的影响。利用斑马鱼行为学系统Noldus来评价α-细辛醚对斑马鱼幼鱼运动方式及运动能力的影响。由试验得到的结果如下：斑马鱼心脏注射大分子荧光染料后，浸泡在养殖水和α-细辛醚中，发现浸泡α-细辛醚30min后斑马鱼的血管有些模糊，周围已经有少量的荧光物质渗出，浸泡α-细辛醚60min后可观察到斑马鱼血管更加的模糊，说明已经有大量的荧光物质从血管内渗出，而对照组却没有看到荧光物质渗出。通过电镜观察的结果显示，给予α-细辛醚后，内皮细胞

7、出现轻度的皱缩，BBB的基膜出现膨大断裂，紧密连接出现疏松。而对照组的内皮细胞未出现皱缩，比较饱满，紧密连接致密，基膜结构完整连续。利用HE组织切片来观察斑马鱼脑组织结构的结果与BBB超微结构的结果相一致。腹腔注射α-细辛醚作用1h后，大部分的Claudin家族基因如Claudin-19、-k、-j、-5a、-7a、-7b、-a、-h、-11a下调。其中Claudin-5b、-11b上调。Claudin-2上下调没有太明显的变化。其他家族的基因如JAM，-2A、-2B、-3A、-3B、occludin-A、occludin-B均下调，下调的幅度却是不尽相同。腹

8、腔注射α-细辛醚后，Claudin5a