基于丙谷二肽的酶促合成研究

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1、天津大学硕士学位论文丙谷二肽的酶促合成研究姓名：于清新申请学位级别：硕士专业：化学工程指导教师：何志敏201006中文摘要本文以重要的肠外营养用药——丙谷二肽的酶法制备为核心内容，设计完成了包括引入保护基、催化肽键合成、脱保护基三步构成的完整合成工艺路线，并对主要酶促合成工艺条件进行了分析优化；在此基础上，引入CLEA技术，对合成中涉及的两种重要酶制剂——木瓜蛋白酶和青霉素G酰化酶进行新型固定化酶技术开发，优化制备条件，考察催化性质，表征形貌结构：同时，开展CLEA微囊化方法的探索研究，为丙谷二肽的高收率、低成本制备提供有益参考，主要研究结果如下：酶促合

2、成丙谷二肽：以木瓜蛋白酶和青霉素G酰化酶为主要反应用酶，成功制得丙谷二肽；全套反应由引入保护基、木瓜蛋白酶酶促肽键合成和青霉素G酰化酶催化脱保护三步构成，各步反应收率最终为86．41％，30．5％和94．8％，总收率为24．98％。；合成过程中，采用HPLC-MS、核磁等手段对产物进行检测鉴定；同时，开发了以制备色谱为主的目标物分离提纯方法。木瓜蛋白酶催化ph觚．舢a．Gln的合成：反应由动力学控制，通过优化工艺条件，得出在pH8．8，25℃，助溶剂乙醇添加量为1．5mL，游离酶浓度O．02g／mL，GlIl浓度O．5mo儿，Pllac．ma旬Me浓度0

3、．05mo儿，添加KCI浓度为O．1mo儿，反应160I血情况下，合成苯乙酰基保护的丙谷二肽收率最高，可达30．5％；将木瓜蛋白酶CLEA应用于反应，15h时收率为9．32％：针对CLEA技术应用中存在的颗粒较小，不利于工业化应用的问题，提出囊化解决方案，制得6种木瓜蛋白酶CLEA微囊，对结构性质进行表征，其中实心海藻酸钙微囊酶活保留最高，达53．42％。青霉素G酰化酶催化脱保护基生成舢a．Gln：将青霉素G酰化酶游离酶应用于A1aGhl的合成，反应0．33h，悼达94．8％；制备得到青霉素G酰化酶CLEA，优化条件为：饱和硫酸铵溶液为沉淀剂，与酶液体积

4、比为2．3：l时为最适用量，戊二醛为交联剂，浓度0．35％，交联时间为2h，温度4℃，最终酶活保留可达52．61％；所得CLEA的最适温度与游离酶相比提高了10℃，因此可以在较高温度下应用；最适pH与游离酶相比向碱性偏移了两个单位，适用范围拓宽：热失活研究表明，高温下青霉素G酰化酶CLEA的热稳定性比游离酶明显提高，反应1．0h，收率为95．6％：实验制得两种青霉素G酰化酶CLEA微囊，其中中空微囊酶活保留可达16．84‰机械强度最高可达7．95N：将青霉素G酰化酶CLEA微囊应用于反应，2．2h时，收率为95．2％。关键词：丙谷二肽、酶促肽合成、cLE

5、A、cLEA微囊ABSTRACTInt11ispaper，eIlzymatics)，Iltllesisof砧a．Gln砌chisaniInponantabentericnutritiousdmgwasconsiderdastllecoreof廿leresearch．ThesyntheticroutemcludmgproteCtioIl，enzymatic拶nthesisofdepeptideanddeprotectionwasSuccessmllydeVeloped．0ntllatbasis，CLEAtechnologywasappliedtothepa

6、paillandPG气bothofthemarekeyeI珂mesiIlsyntlletiziIlg灿a如lILTheconditionsofpreparingCLEAWIereoptiIIlized，thepropeniesofCLEA、ⅣerestudiedaJldthe咖c仃ueofCLEAwasalsoc11amCterized．F0r$nthesiZiIlgAlaGln诵th11i曲yieldand】owcost，CLEAmicfocapsules11aVealsobeenexploreda11dStudied．Theconclusionsca

7、nbedmwnasfbllows：EⅡ巧maticsynthesisof舢a-Gh：Ala如ln吼ssuccessmllysymhesizedbyusingpapain觚dPGA．ThereactionscanbediVidediIno3st印si11cludiIlgprotectioIl’peptidesyntllesisbypapain觚duIlprotectionbyPGA．Theyieldsofthe3Steps眦e86．41％，30．5％锄d94．8％respectively．The丘mlyieldwas24．98％．HPLC-MSandNMR

8、、Ⅳcreusedf．0rdete“nga芏ldidemi研ngproducts