反胶团萃取基因治疗质粒dna的研究

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1、厦门大学硕士学位论文反胶团萃取基因治疗质粒DNA的研究姓名：黄翠云申请学位级别：硕士专业：化学工程指导教师：卢英华20060701摘要摘要1质粒DNA作为生物药剂(尤其作为基因治疗和基因疫苗的载体)的意义和需求越来越大。质粒DNA作为一种新的非病毒转基因载体，优点是安全可靠、稳定、对外源基因的容纳量大、不会引起免疫系统反应及易于生产等。随着基因治疗和DNA疫苗从实验室进入临床研究和批准上市，必须开发出一个经济、简单以及高重复性的质粒分离纯化生产工艺，使其质量达到临床应用的标准。近年来，国外针对生物药剂质粒DNA的分离纯化，开发了机械破碎、碱法裂

2、解等工艺破碎细胞释放质粒，离心或过滤分离细胞碎片、变性蛋白和核酸，醋酸盐和聚乙二醇等澄清和浓缩质粒DNA提取液，反相色谱、离子交换色谱、分子筛色谱，三链DNA．亲和色谱纯化超螺旋质粒DNA等工艺。然而，这些方法耗时复杂，费用高，放大困难，并且市售吸附剂的种类和性能阻碍了色谱法纯化质粒DNA的应用。反胶团萃取是近年发展起来的分离和纯化生物物质的新方法。它是表面活性剂分子溶于非极性溶剂中自发形成的纳米级聚集体，其中表面活性剂的极性头朝内而非极性头朝外与有机溶液接触。胶团内可溶解少量水而形成微型水池，蛋白质、核酸、氨基酸等生物分子溶解在其中，由于胶团

3、的屏蔽作用，这些生物物质不与有机溶液直接接触，起到保护生物物质的活性的作用，从而实现生物物质的溶解和分离。目前反胶团萃取技术主要应用于萃取蛋白质、氨基酸和酶，有关这方面的研究已有大量文献报道。然而，利用该技术萃取核酸，目前国内外仍鲜见报道。反胶团技术与目前所用的昂贵的核酸制备技术(如色谱技术)相比，有很多优势，如高热力学稳定性、易放大、费用低、操作条件温和、萃取过程易精确控制、萃取剂可重新利用等。本文采用碱法裂解提取重组大肠杆菌中的质粒pUK21CMV[31．2和pPhytl48，并利用新的反胶团体系一三辛基甲基氯化铵(ToMAC)／正戊醇／异

4、辛烷以及双十六烷基二甲基溴化铵(2C16QA)／异辛烷／基金项目：留学回国人员基金与厦门大学新世纪优秀人才基金资助I摘要正戊醇萃取水相中的核酸，考察其萃取性能。考察了不同萃取条件如：表面活性剂种类与浓度、离子种类与浓度、水相pH值、萃取时间等对质粒DNA萃取和反萃取的影响。结果表明，离子种类和浓度对质粒DNA的萃取和反萃取都有很大的影响。随着盐浓度增大，萃取率显著下降。同时考察了质粒DNA选择性的问题，确定反胶团的萃取和反萃取RNA以及DNA和RNA混合物的部分条件，以便找到DNA和RNA有效分离的最佳条件，实现二者的分离。正向萃取时，当TOM

5、AC浓度为40mmolL．1，水相pH值8．0--一10．0时，质粒pUK21CMVBI．2和pPhytl48的萃取率最高分别可达到99．09％，97．5％，而大肠杆菌RNA的萃取率甚至达到了100％，相同萃取条件下，2C16QA反胶团体系萃取两种质粒DNA的萃取率达到97．78％，97．47％。反相萃取时，离子浓度0．5molL一，水相pH值4．0时，质粒pUK21CMV[31．2和pPhytl48的反萃取率最高可达到100％，而大肠杆菌RNA的反萃取率却普遍低于70％。离子浓度对核酸的萃取和反萃取过程都有重要影响，通过合理调节水相中的离子浓

6、度，可以实现DNA和RNA的分离。研究结果表明，TOMAC(三辛基甲基氯化铵)／异辛崩正戊醇反胶团体系非常适合质粒DNA的萃取。关键词：反胶团；质粒DNA；萃取；反萃取ⅡAbstractWithongoingidentificationoffunctionalgenesmodemmedicaltreatmentslikegeneticvaccinationorgenethempya陀beginningtoevolvebecausewiththesenoveltherapiesillnesscanbecuredatthegeneticlevel(

7、geno孵)andnotbytreatingthesymptoms(phenoptype)．Productionofnucleicacids越anactivepharmaceuticalingredientO”Dingenetherapyandgeneticvaccinationisgainingmoreandmoreimportance．Non-viraldeliverysystemslikeplasmidDNAhavebecomemoreandmoredesirableastheyarethemostattractivegenetransf

8、ersystemsforcommercialproducts．Non-viralvectorsowntheoreticallyallunlimited