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1、Primer-BLAST是NCBI的引物设计和特异性检验工具。Primer-Blast介绍Primer-BLAST，在线设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物。Primer-BLAST可以直接从Blast主页（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）找到，或是直接用下面的链接进入：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/这个工具整合了目前流行的Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用
2、Blast进行引物特异性验证。并且，Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物–animportantfeatureforPCRprotocolsmeasuringtissuespecificexpression（注：没办法准确的翻译，只好作罢，汗！）。Primer-BLAST有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用Primer3和NCBIBLAST更加准确。Primer-BLAST的输入Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。提交的界面主要包括三个部分：targettemplate（模板区）,theprimers（引物区）
3、,和specificitycheck（特异性验证区）。跟其它的BLAST一样，点击底部的“Advancedparameters”有更多的参数设置。模板（Template）在“PCRTemplate”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用AccessionNumber。如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificitycheck区选择）是唯一的。引物（Primers）如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。可以在PrimerParameters区填入你的一条或一对引物
4、。并且选择好验证的目标数据库（在specificitycheck区选择）。根据需要可设置产物的大小，Tm值等。特异性（Specificity）在specificitycheck区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较重要的。这里提供了4种数据库：RefSeqmRNA,Genome(selectedreferenceassemblies),Genome(allchromosomes),andnr(thestandardnon-redundantdatabase)。前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给出更准确的结果。特别是，当你用NCBI的参考序列作为模板和
5、参考序列数据库作为标准来设计引物时，Primer-BLAST可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。selectedreferenceassemblies包括以下的物种：human,chimpanzee,mouse,rat,cow,dog,chicken,zebrafish,fruitfly,honeybee,Arabidopsis,和rice。Nr数据库覆盖NCBI所有的物种。实例分析用人尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil-DNAglycosylasegenes,UNG,GeneID:7374)的两个转录本序列作为一个例子来分析。UNG1的序列长一点（NM_003362
6、），UNG2的序列短一点（NM_080911，注：拿这两个基因的序列ClustalW一下就可以了）。这里用UNG2的序列设计引物，选择RefSeqmRNAdatabase，物种是Human，其它默认。结果如下图A-B所示，设计的引物只能扩增出UNG2。看上面的图，把“AllowprimertoamplifymRNAsplicevariants”这个选项给勾上，出现的结果如下图-C所示，新的引物也可以扩增出UNG1（注：我试了一下，不能得到预期的结果，可能参数没设对）。Figure.Primer-BLASTresultsforUNGtranscriptvariant2.TheNCBI
7、ReferencesequenceNM_080911wasusedasatemplate.Toppanel:PrimersspecifictothesinglesplicevariantarereportedbydefaultwiththemRNARefSeqdatabaselimitedtohumansequences.Bottompanel:Primersthatamplifybothsplicevariantsarefoundwiththeoptiontoall
