罗非鱼链球菌病分子流行病学研究及thsp70在该病的免疫功能探索

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1、万方数据分类号UDC$943博士学位论文密级——罗非鱼链球菌病分子流行病学研究及tHSP70在该病的免疫功能探索陈明学科专业亟随兽医堂指导教师董维竖：塾援一论文答辩日期垫13生塑旦!Q旦学蝴日期垫!三生鲤旦3Q目答辩委员会主席割椹婴究员万方数据广西大学学位论文原创性和使用授权声明1IIIiillliiilIiIIiiliiiIllllllllIiiliililY2656758本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的

2、学位而使用过的材料。与我一同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。、p本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：口保密，在年解密后适用授权。，耐不保密。(请在以上相应方框内打“√”)论文作者签名：七垂方旷√指导教师签名作者联系电话54日期：J-013，肜·2文日期

3、：刀弓．限72／电子邮箱：cm990919@163．COlll万方数据罗非鱼链球菌病分子流行病学研究及tHSP70在该病的免疫功能探索摘要链球菌病是目前对罗非鱼养殖危害最为严重的病害，呈全球流行，每年给世界罗非鱼养殖造成巨额经济损失，2009---一2012年给中国罗非鱼养殖业造成的经济损失累计达16亿美元。近年该病在中国的流行发生了巨大变化，目前还未找到有效的预防控制措施。本论文对中国罗非鱼主要养殖省区广东、广西、海南、福建及云南近7年(2006"-'2012)链球菌病流行菌株分离鉴定、血清型与基因型分析、菌种更替原因及流行菌株免疫原性进行研究，旨在全面掌握该病病原在我国

4、的流行变化情况；同时，论文通过重组酵母分泌表达获得罗非鱼热休克蛋白70(tHSP70)，并在基因、细胞及机体水平探索了tHSP70在该病的免疫学功能。2006"-'2012年，研究从广西、广东、海南、福建和云南5省罗非鱼集中养殖区共分离到罗非鱼源链球菌临床菌株210株，建立了目前国内菌株来源最广、数量最多、数据最详的罗非鱼链球菌病原库；临床菌株鉴定表明我国罗非鱼链球菌病流行菌种已从过去(2008年前，91．30％)以海豚链球菌为主转变为现在(2009"--'2012，97．86％)以无乳链球菌为主；2009"---'2012年流行的无乳链球菌株存在Ia、Ib和III型3种血

5、清型，其中Ia(94．67％)为绝对优势血清型，各区域流行菌株血清型和PFGE基因型存在地域差异，并且随时间发生变化：罗非万方数据鱼无乳链球菌流行菌株免疫原性与其血清型和PFGE基因型均有关联，很难筛选获得1株疫苗候选菌株可以保护相同血清型内的所有基因型菌株；2008年初南方罕见持续低温天气和菌种致病力差异是我国罗非鱼流行菌种在2008年发生更替的直接原因。研究构建了罗非鱼HSP70蛋白高效、稳定的毕赤酵母分泌表达系统(KM71／pPIC9K／tHSP70)，表达量达30mg／L。重组表达的tHSP70具有ATPase和结合蛋白多肽的生物学活性；tHSP70(100pg／m

6、L)可显著增强罗非鱼腹腔巨噬细胞的贴壁和生长、NO释放及吞噬海豚链球菌菌体抗原能力；tHSP70(10og／mL)可极显著提高海豚链球菌菌体诱导罗非鱼淋巴细胞的增殖妒<0．01)，并可减轻海豚链球菌胞外产物(ECP)对淋巴细胞增殖的抑制作用；基因表达分析显示，tHSP70可显著增强海豚链球菌体外诱导罗非鱼腹腔巨噬细胞IL一8、HSP70、CXCR4和PGRN四个基因，以及罗非鱼外周血淋巴细胞ICER、PGK、MMP9和MHCII四个基因的表达∽

7、6．78％和69．09％，极显著高于其它口服免疫对照组伊<0．01)。本研究全面掌握了近7年我国罗非鱼链球菌病发病规律及其病原分布与变化特征，并阐明了2008年流行菌种更替原因，为该病科学防控和疫苗研发应用提供了直接依据；研究从基因、细胞和机体水平探索了tHsP70在罗非鱼链球菌病中的免疫学功能，初步证实tHSP70具有很好的免疫佐剂功能，为今后利用HSP70开发新型口服鱼类疫苗奠lI万方数据定了基础。苗关键词：罗非鱼海豚链球菌无乳链球菌热休克蛋白70疫万方数据MoLECULAREPIDEMIoLOGYSTUDYo