慢病毒介导reck基因治疗胰腺癌实验的研究

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1、慢病毒介导的RECK笨冈治疗胰腺癌的实验研究中文摘要慢病毒介导的RECK基因治疗胰腺癌的实验研究中文摘要第一部分RECK基因在胰腺癌中的表达及意义目的观察人胰腺癌组织及细胞株中RECK基因的表达，探讨其与胰腺癌临床病理特征之间的关系。方法采用免疫组化S．P法检测42例胰腺癌及相应正常胰腺组织中RECK蛋白的表达，采用WesternBlotting法检测人胰腺癌细胞株PANC．1、MIAPaCa-2和AsPC．1中RECK蛋白的表达，应用SPSSl3．0软件对RECK蛋白的表达与肿瘤临床病理特征之间的关系进行统计学分析

2、。结果RECK蛋白在三株胰腺癌细胞中均不表达。胰腺癌组织中的RECK蛋白阳性表达率为45．2％(19／42)，正常胰腺组织中的阳性表达率88．1％(37／42)，两者差异显著(火O。01)。胰腺癌TNM分期为I+II期组的RECK阳性表达率(58．3％，14／24)明显高于HI+IV期组(27．8％，5／18，P<0．05)；无淋巴结转移组RECK阳性表达率(58．6％，17／29)明显高于有淋巴结转移组(15．4％，2／13，P<0．01)；无局部浸润组RECK阳性表达率(71．4％，10／14)明显高于有局部浸润

3、组(32．1％，9／28，P<0．05)。结论RECK在胰腺癌组织和细胞株中表达减少或缺失，与胰腺癌的侵袭转移密切相关，可能成为预测胰腺癌患者预后的一个新指标。第二部分RECK基因重组慢病毒载体的构建目的构建并包装含有RECK基因的重组慢病毒载体，为其体内外实验研究奠定基础。方法采用PCR技术从质粒克隆模板pINCY-RECK中钓取RECK基因，并将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒pC_d2．FU中，构建慢病毒载体表达质粒pGC．F1J．RECK，通过PCR鉴定、测序验证RECK基因，用pGC．FU．RECK转染293

4、T细胞行WesternBlotting检测RECK蛋白，将pOC—FU—RECK质粒和包装质粒中文摘要慢病毒介导的RECK基因治疗胰腺癌的实验研究pHelperl．0、pHelper2．0共转染293T细胞，包装产生携带RECK基因的重组慢病毒Lv-RECK，测定其滴度。结果(1)pGC．FU．RECK中携有正确的RECK基因，并能在293T细胞中表达；(2)pGC．FU．RECK共转染包装细胞293T能产生重组慢病毒LV-RECK，滴度为2x108TU／ml。结论成功构建了RECK基因的重组慢病毒载体，为研究REC

5、K基因在胰腺癌中的生物学功能和基因治疗奠定基础。第三部分RECK基因重组慢病毒感染人胰腺癌细胞PANC．1的体外实验研究目的观察RECK基因过表达对人胰腺癌细胞株PANC．1生物学行为的影响。方法用LV-RECK感染人胰腺癌细胞株PANC．1，测定感染效率。采用Real．timePCR、WesternBlotting法检测RECK基因的表达，MTT法检测PANC—l细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡，Transwell小室检测细胞侵袭力，MMP．2、MMP．9的表达和活性检测采用Real．timePCR、Weste

6、rnBlotting及明胶酶谱法。结果LV-RECK成功感染PANC．1细胞，感染效率85％以上。与阴性对照组和空白对照组比较，实验组PANC．1细胞的RECKmRNA和蛋白的表达明显增加(p0．05)，三组细胞中MMP．2、MMP．9的表达亦无明显差异(尸>0．05)。结论RECK基因重组慢病毒可以高效感染PANC一1细胞，可介导RECK基因在PANC

7、．1中表达。RECK基因过表达不影响PANC-1细胞的增殖和凋亡，也不影响MMP．2、MMP．9基因的表达，但是可以在翻译后水平抑制MMP．2、MMP．9，进而有效抑制PANC．1细胞体外侵袭力。第四部分重组RECK基因治疗胰腺癌的体内实验研究目的观察LV-RECK对人胰腺癌动物模型的治疗作用。方法建立人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，随机分为实验组、阴性对照组和空白1l慢病毒介导的RECK摹因治疗胰腺癌的实验研究中文摘要对照组，分别在瘤内注射LV-RECK、LV-EGFP、生理盐水，观察抑瘤效果及肝肺转移情况，免疫组化S

8、．P法检测RECK蛋白表达及MVD值，TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡，并进行生存分析。结果与阴性对照组和空白对照组比较，实验组皮下移植瘤体积明显缩小(P<0．05)，抑瘤率为52．68％；实验组RECK蛋白重获表达，MVD值明显降低(P