黑茶藨子（ribes+nigrum+l.）含cytb-%2c5-结构域脱氢酶基因克隆和功能的研究

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1、中文摘要黑茶蔗子含Cytb。结构域脱氢酶基因的克隆与功能研究论文作者：陆万香指导教师：李名扬教授胡赞民副研究员(西南农业大学，中国，重庆，400716)含Cytb5结构域的脱氢酶是近些年发现的一类新的小家族蛋白，这些蛋白都含有一个标志cytb5蛋白特征的血色素结合区：“His-Pro．Gly—Glydomain”；同时，它们还含有膜结合脱氢酶所必需的三个保守的“HisBox”，通常为HisI区HX(34)H、HisII区HⅪ2．3)HH和HisIII区(H／Q)x(圳HH。现已知：△6-、△5一和△4碍旨肪酸脱氢酶、脂肪酸羟基化酶以及△8-鞘脂脱氢酶是该家族蛋白的主要成员。在植物中

2、，此类蛋白研究最多的是△6．脂肪酸脱氢酶和△8．鞘脂脱氢酶，前者是Y．亚麻酸生产中的关键酶，后者可能涉及植物的细胞程序性死亡和抗逆作用，因此具有重要研究意义。本研究以富含T．亚麻酸的植物黑茶蔗子(RibesnigrumL．)为材料，利用基因组步移方法从黑茶蔗子DNA中克隆获得了多个含Cytb5结构域的脱氢酶基因，通过酿酒酵母异源表达初步鉴定了基因功能，并进行了基因间功能差异和进化关系等方面的分析研究。主要研究结果如下：l含Cytb5结构域脱氢酶基因的克隆根据已知的△6一脂肪酸脱氢酶和△8．鞘脂脱氢酶保守区序列设计简并引物，以黑茶蔗予DNA为模板，通过PCR扩增技术，共获得三个约10

3、32bp大小的脱氢酶相关基因的中间片断。在此基础上，利用基因组步移技术，获得两个含Cytbs结构域的脱氢酶相关基因的全长序YtJRnCyDA、RnCyDB，以及一个含有ATG起始密码子的含Cytbs结构域的脱氢酶相关基因片断RnCyDC。RnCyDA、RnCyDB全长1347bp，编码448个氨基酸，RnCyDB第54位含一个终止子；RnCyDC片断长1140bp。RnCyDA、RnCyDB：自i]RnCyDC具有共同特点：在第41aa位点处具有Cytbs蛋白标j喜的HPGGdomain，在159～163aa、196～200aa、375-西南农业大学博士学位论文380aa位点处分别

4、具有膜结合脱氢酶标志的三个“HisBox”。2RnCyDB的定点突变和嵌合基gIRnCyDCA、RnCyDCB的构建对胄拧c如蹉因第160位碱基“T”突变为“C”，使编码终止子的引唧AA”突变为编码“Q”的“旧CAA”，获得改造后的基因RnCyDBl。将RnCyDA、RnCyDB尾部208bp序列分别与片断RnCyDC构建成具有1347bp完整ORF的嵌合基因RnCyDCA和RnCyDCB。3生物信息学分析分别对RnCyDA、RnCyDBl和RnCyDCAm进行了初步的生物信息学分析，根据获得的预测信息绘制了相应的拓扑结构图，进一步分析了ER膜结合蛋白结构与功能的关系。4外源基因在

5、酿酒酵母的诱导表达及其功能鉴定分别将RnCyDA、RnCyDBl和RnCyDCA／B构建酿酒酵母表达载体，采用LiAC转化方法进行小量酵母转化，获得含有各表达载体的酵母转化子，对各转化菌株进行诱导培养表达实验。提取酵母产物中鞘J]日LCB进行氧化和甲酯化或提取酵母产物脂肪酸并甲酯化，利用GC．MS鉴定各组分变化。检测结果显示RnCyDA能够利用酿酒酵母中的植物鞘胺醇生成8．植物鞘胺醇，j,正91]RnCyDAn-I"能具有△8-鞘脂脱氢酶功能。P．nCyDCA和RnCyDCB均能将LA和ALA分别转化为GLA和OTA，证明它们具有A6．脂肪酸脱氨酶功能，而且RnCyDCB具有[：I

6、：RnCyDCA更高的底物转化效率。未发现RnCyDBl具有△8一鞘脂脱氢酶或△6．脂肪酸脱氢酶功能。sR丑CyaB、RnCyDCA、IhcyDcB间功能差异分析分析嵌合蛋白RnCyDCA和RnCyOCB的结构与功能关系，推钡[[R．nCyDCN域是△6．脂肪酸脱氢酶主要功能区域，尾部区域的嵌入，不仅可能保证脱氢酶在ER膜上的正常定位，而且更大可能使蛋白质各级结构完整，从而保证嵌合蛋白具有功能。分析RnC：yDBl和RnCyDCB的功能差异，推测RnCyDB和RnCyDCB在Cytb5区域与第一个“HisBox”之间的结构差异引起两者功能差异。分析RnCyDCA和RnCyDCB功能

7、差异，推测可能是一个cAMP依赖性蛋白激酶的磷酸化位点的存在增强了RnCyDCB的功能。“中文摘要6RnCyDA、RnCyDB和RnCyDC之间进化关系分析RnCyDA、RncyDB和RncyDc与其它植物△8．鞘脂脱氯酶ff口A6一脂肪酸脱氯酶组成的进化树显示：高等植物含Cytb5结构域蛋白的主要进化方式是由△8一鞘脂脱氢酶进化生成△6-脂肪酸脱氢酶。RnCyDB极可能是在△8．鞘脂脱氢酶基I羽RnCyDA进化到△6-脂肪酸脱氢酶基因RnCyDC过程中产生的假基因，