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时间:2019-03-08
《中国特有濒危植物穗花杉遗传多样性分析及其保育》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、摘要从7个天然居群(井冈山西平、井冈山和遂川交界处、铜鼓龙门、宜丰官山大西坑、小西坑、宜春明月山和军峰山)和一个栽培居群(庐山居群)采集穗花杉样本,以改良CTAB法从穗花杉叶片中制备模板DNA,优化了PCR循环参数,建立了RAPD.PCR和ISSR—PCR扩增的最佳反应体系,筛选出能扩增多态性片段较多且扩增稳定的引物,通过用12条RAPD引物和10条tSSR引物分别对74个和66个穗花杉个体的基因组DNA进行扩增,对穗花杉居群的遗传多样性和遗传结构进行了研究。实验结果表明CTAB提取液中丙酮去色素处理可以提高产物的纯度,但产率较低;另外
2、CTAB提取液的抽提时间对产率影响较小。RAPD、PCR扩增条件经过优化后确定为20棚PCR反应体系中,10xBuffer缓冲液2/al,模板70ng,Mg”2.0rnmoVL,dNTPs0.2mmol/L,引物O,609mol/L,Taq酶1.5U;RAPD最佳扩增程序为94。C5rain,】个循环;94℃】rain、37℃】rain、72℃2rain,40个循环;72。C】0min,1个循环。ISSR扩增条件经过优化后确定为:20ⅢPCR反应体系中,2}1110xTaq酶配套缓冲液,】.8UTaq聚合酶(上海生工公司),0,2肚mo
3、l/l引物,0.18mmol/!dNTPs,1.5~2.5mmol/1MgCl2,10n∥斗l模板DNA;ISSR—PCR扩增反应程序:94。C5mitt,1个循环;94。C30S,50。C(46—54。C不定)45S,72。C1.5rain,35个循环;72。C7rain,1个循环;4。C30rain。本研究共对120条RAPD引物和100条ISSR引物进行了筛选,分别筛选出扩增条带较多、信号强、背景清晰的12条RAPD引物和10条1SSR引物用于8个居群DNA样本扩增。结果为:RAPD标记技术共产生了90条带,其中多态性带为78条,
4、多态性位点百分率(PPL)为8667%;ISSR引物标记技术共产生了61条带,其中多态性带为51条,多态性百分率(PPL)83.61%。根据不同个体的扩增图谱构建了0、1矩阵(其中模糊带和弱带不计)输入计算机。对RAPD数据处理结果如下:POPGENE分析结果表明,穗花杉具有丰富的遗传多样性,官山大西坑(DK)居群遗传多样性水平最高(PPL=74.44%,h=O.3178,1=0.4567),庐山(LS)居群的遗传多样性水平最低(PPL=10%,h=0.0414,I=0.0605)。Nei,s遗传多样性分析和AMOVA分析表明,穗花杉居
5、群间出现了一定的遗传分化(G。。=O.2619,m;。=】9.89%)。居群间一定程度的遗传分化可能是由于基因流受阻造成的。根据NeilS遗传距离矩阵构建居群间的遗传关系树状图。由UPGMA聚类分析可知,西平居群和遂川居群先聚为一支,后与庐山居群聚在一起,推测庐山居群是它们的后裔。对ISSR数据处理结果如下:POPGENE分析表明,与其他的裸予植物相比,穗花杉具有丰富的遗传多样性(Ht=0.293l、Hs=0.2135)。Nei,S遗传多样性和AMOVA分析表明,居群间存在有~定的遗传分化(Gst=O.2710,o日=2662%)。由U
6、PGMA聚类分析可知,大西坑和小西坑两个居群优先聚类,铜鼓和军峰山聚为一支,西平和遂川聚为一支,居群的亲缘关系与地理距离有一定的相关性。鉴于穗花杉对生境改变适应性差和对人为干扰敏感,群落稳定性在穗花杉居群遗传多样性保护中的特殊地位,建议把大西坑(DK)和小西坑(XK)居群划入官山自然保护区的保护范围,对其生存空间进行长期、有效的保护。另~方面,在居群间进行植株和幼苗的相互移栽,以提高屠群间的基因交流,最大限度保护穗花杉的遗传多样性。关键词:穗花杉,RAPD技术,ISSR技术,遗传多样性,遗传结构,保护策略保育AbstractTherev
7、isorymethodCTABwasusedtoextractDNAfromAmentotaxusArgotaenia(Hance)Pilgerplant-leaveswhichweregatheredfromlushanMountain、JinggangshanMountain、LongmenofTonggu、MingyueshanMountainandJunfengMountaininYichunandGuanshanMountaininYifeng.Therecyclingparameterswereoptimizedandopt
8、imalreactionsystemsuitableforRAPD·-PCRandISSR—PCRamplificationwasestablishedinthepaper.RAPDassessmentof
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