中国特有濒危植物穗花杉遗传多样性分析及其保育

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1、摘要从7个天然居群(井冈山西平、井冈山和遂川交界处、铜鼓龙门、宜丰官山大西坑、小西坑、宜春明月山和军峰山)和一个栽培居群(庐山居群)采集穗花杉样本，以改良CTAB法从穗花杉叶片中制备模板DNA，优化了PCR循环参数，建立了RAPD．PCR和ISSR—PCR扩增的最佳反应体系，筛选出能扩增多态性片段较多且扩增稳定的引物，通过用12条RAPD引物和10条tSSR引物分别对74个和66个穗花杉个体的基因组DNA进行扩增，对穗花杉居群的遗传多样性和遗传结构进行了研究。实验结果表明CTAB提取液中丙酮去色素处理可以提高产物的纯度，但产率较低；另外

2、CTAB提取液的抽提时间对产率影响较小。RAPD、PCR扩增条件经过优化后确定为20棚PCR反应体系中，10xBuffer缓冲液2／al，模板70ng，Mg”2．0rnmoVL，dNTPs0．2mmol／L，引物O，609mol／L，Taq酶1．5U；RAPD最佳扩增程序为94。C5rain，】个循环；94℃】rain、37℃】rain、72℃2rain，40个循环；72。C】0min，1个循环。ISSR扩增条件经过优化后确定为：20ⅢPCR反应体系中，2}1110xTaq酶配套缓冲液，】．8UTaq聚合酶(上海生工公司)，0,2肚mo

3、l／l引物，0．18mmol／!dNTPs，1．5～2．5mmol／1MgCl2，10n∥斗l模板DNA；ISSR—PCR扩增反应程序：94。C5mitt，1个循环；94。C30S，50。C(46—54。C不定)45S，72。C1．5rain，35个循环；72。C7rain，1个循环；4。C30rain。本研究共对120条RAPD引物和100条ISSR引物进行了筛选，分别筛选出扩增条带较多、信号强、背景清晰的12条RAPD引物和10条1SSR引物用于8个居群DNA样本扩增。结果为：RAPD标记技术共产生了90条带，其中多态性带为78条，

4、多态性位点百分率(PPL)为8667％；ISSR引物标记技术共产生了61条带，其中多态性带为51条，多态性百分率(PPL)83．61％。根据不同个体的扩增图谱构建了0、1矩阵(其中模糊带和弱带不计)输入计算机。对RAPD数据处理结果如下：POPGENE分析结果表明，穗花杉具有丰富的遗传多样性，官山大西坑(DK)居群遗传多样性水平最高(PPL=74．44％，h=O．3178，1=0．4567)，庐山(LS)居群的遗传多样性水平最低(PPL=10％，h=0．0414，I=0．0605)。Nei，s遗传多样性分析和AMOVA分析表明，穗花杉居

5、群间出现了一定的遗传分化(G。。=O．2619，m；。=】9．89％)。居群间一定程度的遗传分化可能是由于基因流受阻造成的。根据NeilS遗传距离矩阵构建居群间的遗传关系树状图。由UPGMA聚类分析可知，西平居群和遂川居群先聚为一支，后与庐山居群聚在一起，推测庐山居群是它们的后裔。对ISSR数据处理结果如下：POPGENE分析表明，与其他的裸予植物相比，穗花杉具有丰富的遗传多样性(Ht=0．293l、Hs=0．2135)。Nei，S遗传多样性和AMOVA分析表明，居群间存在有～定的遗传分化(Gst=O．2710，o日=2662％)。由U

6、PGMA聚类分析可知，大西坑和小西坑两个居群优先聚类，铜鼓和军峰山聚为一支，西平和遂川聚为一支，居群的亲缘关系与地理距离有一定的相关性。鉴于穗花杉对生境改变适应性差和对人为干扰敏感，群落稳定性在穗花杉居群遗传多样性保护中的特殊地位，建议把大西坑(DK)和小西坑(XK)居群划入官山自然保护区的保护范围，对其生存空间进行长期、有效的保护。另～方面，在居群间进行植株和幼苗的相互移栽，以提高屠群间的基因交流，最大限度保护穗花杉的遗传多样性。关键词：穗花杉，RAPD技术，ISSR技术，遗传多样性，遗传结构，保护策略保育AbstractTherev

7、isorymethodCTABwasusedtoextractDNAfromAmentotaxusArgotaenia(Hance)Pilgerplant-leaveswhichweregatheredfromlushanMountain、JinggangshanMountain、LongmenofTonggu、MingyueshanMountainandJunfengMountaininYichunandGuanshanMountaininYifeng．Therecyclingparameterswereoptimizedandopt

8、imalreactionsystemsuitableforRAPD·-PCRandISSR—PCRamplificationwasestablishedinthepaper．RAPDassessmentof