植物功能基因组研究方法及进展

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1、万方数据万方数据万方数据第22卷第6期生物学杂志V01．22No．6，：盟王：：星22旦娑j2：呈：2尘垡2：：：：唑基因敲除作为功能基因组学方法，在动物小鼠以及酵母等中使用较为广泛，但在植物中仅在苔藓植物Physco施trellapaterz中使用得较为成功。尽管在高等植物中做了大量的实验，但大部分都是不成功的，或至少是用常规途径是不可行的【12J。4基因陷阱基因陷阱是新近发展起来的一种反义遗传学方法，它主要依靠报告基因的随机插入来产生融合转录物或融合蛋白，通过检测报道基因而推知基因及其功能。因这系列方法酷似以报道基因为诱饵来捕获基因，故得名基因陷阱。目前已发展了三种不同的陷阱系统

2、，包括增强子陷阱，启动于陷阱和基因陷阱。它们之问最大的不同体现在报道基因重组体的组成和插人位置上。基因陷阱是这三种方法的统称。下面就对这三种系统作一简略介绍。增强子陷阱(enhancertrap)是将某报道基因与一个精巧的启动子相连，组成一增强子陷阱重组体，它不会自主起始转录，而需由被插入的细胞基因组中的增强子帮助才可转录。若报道基因最终表达，则可推知插人点附近有增强子，或有基因，即实现了以该增强子陷阱重组体发现增强子的目的。启动子陷阱(promotertrap)是通过将报道基因插入到细胞基因组的外显子上，一旦发现它与细胞基因组基因被共同转录或表达，则可知该报道基因附近有启动子，从而

3、起到了以之为诱饵，发现启动子的目的，该策略即为启动子陷阱。基因陷阱(genetrap)是由报道基因、剪接供体(splicingdonor，SD)和剪接受体(splicingacceptor，SA)组成(SD及SA序列被构建在报道基因上游)，当重组体插人到细胞基因组的内含子中，由于剪接供体与剪接受体序列的作用而使报道基因不会在转录后修饰的过程中被剪切掉，而能够随着基因转录和表达，故如能检测到报告基因的转录物或蛋白，则证明插入位置附近有基因存在。基于Ac／Ds【l“转座元件及T—DNA[“1的基因陷阱载体已成功用于拟南芥、水稻、玉米、番茄等。基因陷阱在功能基因组的工作中将越来越重要，将成

4、为揭示植物基因组奥秘的又一有力武器。基因陷阱技术的优势在于它只在表达水平上定位基因，细胞基因本身的转录和表达不受影响，所以可检测功能上多余的基因，也可检测在基因表达多个水平上都有作用的基因，或低水平表达的重要基因，而以前的功能基因组学的方法对这些基因都是无法确定的。同其他的方法一样，基因陷阱技术也存在着局限性与不足。启动子陷阱和基因陷阱都有位置限制，前者需插入到外显子，后者则需插入到内含子，增强子陷阱虽没有此位置限制，但由于增强子与基因的位置可近可远，故增强子陷阱不易定位基因。同时，利用基因陷阱技术捕获的基因不一定有很强的表达方式，所以可能检测不到有效的突变表型，若报道基因没按预期加

5、以整合，或报道基因在剪接时整个被切除，都可能使报道基因表型丧失而使后续的基因定位无从着手。此外，对启动子陷阱和基因陷阱而言，插入对细胞有一定的伤害，可能导致基因失活。5化学诱变的新发展——啊uJNG技术化学诱变是最早应用的全基因组突变方式，一些诱变剂可以稳定的产生大量突变群体，并已广泛用于农作物的诱变育种。EMS(ethylmethanesulfonate)是一种高效的烷基化诱变剂，可诱导碱基从c到T的改变，从而导致碱基对从C／G到T／A的转换突变，并可根据植物的氨基酸编码习惯对突变的比例作出大概预测。但化学诱变同时引入了大量的点突变，使得后续的表型分析变得相当困难。美国FredHu

6、tchinson癌症研究中心SlevenHenikoff领导的研究小组将传统的化学诱变、PER技术及高通量的检测技术相结合，发展了一种全新的反向遗传学法——ⅡⅡ』NG技术。TIIJJNG．即targetinginducedlocallesionsingenomes(定向诱导基因组局部突变技术)，该技术借助高通量、标准化的检测手段，快速有效地从经化学诱变剂(EMS)诱变过的突变群体中鉴定出点突变。TILLING技术的技术路线为：种子先经EMS处理并产生一系列点突变；种子经过培养后，获得第一代突变个体(M1)；nl植株自花授粉，产生第二代植株(M2)；M2植株个体抽提DNA存放于96孔微

7、量滴定板，并保留％代种子；将多个96孔微量滴定板合并到一个96孔板内从而得到DNA池；根据目标基因序列设计一对特异引物进行FCR扩增，两个引物分别用700nm和800nm荧光染料标记；PCR扩增的片断变性、退火，从而得到野生型和突变型所形成的异源双链核酸分子；异源的双链核酸分子存在碱基错配，利用可识别错配碱基并在3’端进行切割的CELl酶酶切；酶切产物用变性的聚丙稀酰胺(PAGE)凝胶进行分离，然后用标准的图像处理程序分析电泳图像，获得突变池；利用相同方法