益妇宁延缓大鼠卵巢衰老的药效与机制研究

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1、南方医科大学2013级硕士学位论文益妇宁延缓大鼠卵巢衰老的药效与机制研究Anti．agingEffectsofYFNandItsMechanismonratOvary课题来源：1．国家自然科学基金青年基金(No．81001701)。2．中国博士后科学基金第52批面上项目(No．2012M521939)。学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院彭娟邓虹珠教授中药学学术型硕士研究生中医药学院2013年3月29日广州硕士学位论文益妇宁延缓大鼠卵巢衰老的药效与机制研究硕士研究生：彭娟指导老师：邓虹珠摘要卵

2、巢衰老是从生殖成熟以后才开始或者加速的。它是一个具有普遍性、累积性、渐进性、内生性的生命的过程，是雌性生物的共同特征。围绝经期妇女最突出的变化是卵巢老化，重量减轻，卵巢体积减小，其表面皱缩不平及质地变硬，卵泡用尽或剩余卵泡对促性腺激素的刺激不敏感，合成与分泌性激素减少。目前，卵巢衰老有关的病因机制尚不完全明确，遗传因素、某些外来因素(如放疗、化疗、毒素、卵巢外伤或手术)、体内的内分泌因子、生长因子、细胞因子等因素都对卵巢衰老产生影响。卵巢的老化不但与神经．内分泌．免疫系统变化有关，且与其内在老化机制，步入围

3、绝经期，卵巢会自主性失去器官功能，正常卵泡闭锁过程加快，或卵子被各种机制破坏，导致卵泡的耗竭，卵母细胞萎缩，卵巢颗粒细胞凋亡等有关。现代医学用于治疗卵巢衰老的药物主要有激素补充治疗、促排卵治疗、免疫抑制剂及赠卵治疗等，但均没有令人满意的疗效；激素替代疗法(Ⅷ玎)由于疗程长，副作用大，且对乳房及雌激素靶器官存在潜在的危险，使患者体重增加，心里承受压力增大，恐惧致癌，等等。因此，越来越多的学者把目光转移至中医药对此病的研究、预防及治疗上。益妇宁删)为治疗妇女围绝经期综合症的中药复方，该方由君药哈蟆油和臣药莪术组

4、成，具有补肾益精，调和气血，消积祛浊之功效。已有动物实验和临床研究表明该方其具有抗氧化，抗衰老作用，能升高去卵巢模型大鼠血清E2水平，升高子宫、肾上腺指数，同时还可以调节免疫系统，下丘脑、垂体和血摘要浆B．内啡肽、5．羟色胺、去甲肾上腺素和多巴胺含量。也就是说，YFN在作用于摘除卵巢的动物时，能通过改善下丘脑．垂体．性腺轴的神经内分泌功能，调节外周血激素水平，并且明显改善临床妇女围绝经期症状，那么YFN是否直接影响卵巢功能尚无证据。目的YFN为哈蟆油的复方，已有的细胞生物学实验及动物体内机制研究实验表明哈蟆

5、油能促进卵巢颗粒细胞雌二醇的分泌及细胞增殖作用，同时哈蟆油还能改善卵巢衰老的病理状态及下调细胞周期负性因子，因此，前期的实验基础为YFN治疗卵巢衰老提供了确切的实验依据。但目前对该方的研究尚缺乏有效成分的控制和该方对卵巢衰老作用的整体动物药效及机制的验证，所以本课题进行有效成分初步研究及整体药效研究，并结合前期细胞研究结果和动物药理研究结果进一步探讨其延缓大鼠卵巢衰老的作用机制，为本方治疗围绝经期卵巢衰老提供宏观水平的应用依据。方法1．益妇宁有效成分的初步研究采用考马斯亮蓝法及紫外分光光度法对测定YFN及君

6、药哈蟆油中蛋白质及氨基酸含量。采用高效液相色谱法检测YFN和哈蟆油中有效成分雌二醇，1．甲基海因，亚油酸，维生素E及益妇宁中莪术醇含量。2．YFN延缓大鼠卵巢衰老的药效研究2．1动物模型的建立、分组及给药方法选取24只16．18个月龄自然老化的SD雌鼠模型。按体重随机分为老年对照组(O—C组)、阳性对照己烯雌酚片组(DT组，0．05mg／kg)、益妇宁高剂量组(YEN．H组，相当于含生药材2．09／kg)、低剂量组(YEN-L组，相当于含生药材1．09／kg)，每组动物6只。另选3-4月龄SD大鼠6只作青年

7、对照组(Y-C组)。连续灌胃给药6周。II硕士学位论文2．2标本的采集及研究方法(1)观察大鼠进食、饮水、毛色等一般情况及大鼠体重变化；采集标本前两周检测各组大鼠阴道上皮角化情况，计算动情周期天数；(2)末次给药后动物禁食12h，各组大鼠腹主动脉采血，分离血清，采用电化学发光法检测外周血清性激素指标雌二醇(E2)、睾酮(Te)、孕酮(P)含量；(3)剖取卵巢和子宫进行称重，计算脏器指数：脏器指数=组织湿重(mg)／体重(g)x100％；(3)各组大鼠卵巢、子宫、阴道组织用甲醛溶液固定，制作石蜡组织切片，通过

8、HE染色观察卵巢、子宫、阴道等生殖器官组织病理学变化。3．YFN延缓大鼠卵巢衰老的机制研究3．1抗氧化作用机制(1)采用紫外分光光度法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH．PX)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)、过氧化氢(I-1202)的含量，并取肝组织冰浴匀浆，分别测定SOD、CAT活性和MDA、H202含量；(2)免疫组化检测卵巢组织中氧化应激蛋白p53及DNA损伤标记物8