流动介质中微流控芯片体系肺癌细胞耐药性分析

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1、流动介质中微流控芯片体系肺癌细胞耐药性分析硕士生姓名：辛旨导教师：专业名称：赵龙王琪教授内科学摘要目的：构建能够模拟体内微循环状态的微流控体系，并于流动介质中进行长时间肺癌细胞培养并进行耐药蛋白检测及耐药性分析。微全分析系统或者叫做芯片实验室因其具有集成化、成本低、体积小、灵敏度高、检出率高、试剂消耗少和检测时间短等优点，受到了生物化学界乃至医学界的广泛关注。由于芯片中微通道的尺寸和体内微血管的尺寸相仿，如果能与微流体控制装置相连接，液体可在通道中循环流动，那么将会模拟体内的微循环状态。但是目前大

2、多数研究中，模拟体内微循环的微流控体系尚未构建，而且于微流控体系流动介质中连续完成细胞培养和药物分析及细胞功能检测的研究尚不多。而于静态常规实验平台相比如果能在流动介质中进行肿瘤耐药性研究，可能更具有临床应用价值。肺癌是全球性的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在世界范围的肿瘤性疾病中均居首位。化疗是肺癌的主要治疗方法，但是由于肺癌对很多化疗药物产生耐受常常导致治疗失败。肺癌耐药机制比较复杂，一般可分为内源性耐药和获得性耐药。因此，迫切需要探明肺癌耐药机制，通过各种途径逆转其耐药性。、肿瘤多药耐药(Mul

3、tiDrugResistance，MDR)是指一种药物作用于肿瘤使之产生耐药性后，该肿瘤对未接触过的、结构无关、机制各异的多种抗肿瘤药也具有交叉耐药性的现象。经大量研究证实，P糖蛋白(P．gP)过表达是MDR主要原因。P糖蛋白是一种定位于细胞膜的药物转运泵，能将进入细胞的化疗药泵出细胞外进而产生耐药。然而在人肺癌标准细胞株中进行P糖蛋白研究的尚不多。方法：本研究以人标准肺腺癌细胞株SPCA为研究对象。我们在单通道细胞芯片上连接微泵，构建微流控体系，并在此体系中进行细胞培养。为探求合适流速，分别于1

4、rnm／24h，5mm／24h，10mm／24h和l5mm／24h四种流速控制下进行细胞培养，并观察细胞形态。为探求培养时间，在流速约为15mm／24h的条件下连续培养，分别于注入芯片后的24h，48h，72h及96h观察细胞，并应用台盼蓝染色检测细胞活性。为了检测此实验平台的应用性，首先用其检测P糖蛋白在SPCA中的表达，于系统中在有(实验组)，无(对照组)Ca2+拮抗剂维拉帕米的抑制下P糖蛋白在蛋白水平的表达。进一步探索P糖蛋白对拓扑异构酶II抑制剂一VPl6的耐药作用：对照组和实验组中均加入

5、VPl6诱导细胞凋亡，应用PI染色检测凋亡，为了验证此体系中所得的凋亡检测结果可靠性，在常规实验平台中利用流式细胞技术，采用磷脂结合蛋白V(AnnexinV)联合碘化丙啶(PI)双参数法测定细胞凋亡率。结果：我们成功的实现了在此微流控体系中进行细胞培养，在四种不同的流速下，我们可见，当速度达到15mm／24h时，因冲击力较大，细胞形态变圆并有部分细胞被冲走，故流控速度应低于15mm／24h。在流速约为15mm／24h条件下连续培养细胞4天，可见体系中细胞生长及增殖良好，台盼蓝染色可见细胞死亡率小于

6、1％。细胞免疫荧光化学检测P糖蛋白表达，在488nm激发光激发作用下，可见细胞膜上有绿色荧光，实验组中荧光强度有明显减弱，即P糖蛋白的表达明显降低。PI染色检测细胞凋亡率可见实验组细胞凋亡率明显高于对照组。在普通实验平台流式细胞术结果可见实验组细胞凋亡率大于对照组的2倍，实验组19．94％，对照组8．63％。结果与微流控平台呈现了良好的相关性。结论：我们建立了能够模拟体内微循环的微流控体系，此体系在医学中可用于长时间细胞培养及功能性检测，而且此微流控平台还体现了试剂消耗量低、操作简便、高度集成性等

7、诸多优点。我们还发现：P糖蛋白的表达抑制了拓扑异构酶II抑制剂一VPl6诱导的细胞凋亡，提示P糖蛋白与肺癌耐药密切相关。关键词：SPCAP糖蛋白微流控芯片实验室VPl6化疗耐药CHEMOTHERAPYRESISTANCEOFLUNGCANCERCELLSBASED0NMICROFLUIDICSYSTEMINFLOWMEDIUMMasterdegreecandidate：ZhaoLongSupervisor：ProfessorWangQiMajor：MasterAbstraetObjective：T

8、hisworkaimedatsettingamicrofluidicsystemwhichcanmimicmicrocirculationinvivo．Longtimecellculture，proteindetectionandchemotherapyanalysiscanbefinishedthroughflowmediuminthesystem．Theintegrationofvariouschemicaldevicesandcomplexoperationsontoamic