甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究

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分类号华中农业大学硕士学位论文密级甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究TheDisease．．ResistanceMechanismsandGeneticResearchofANewBrassicaNapuswhichisResistanttotheSclerotiniaSclerotiorum硕士研究生：赵姣姣学号：2010301110091指导教师：李再云教授指导小组：李再云教授葛贤宏副教授专业：作物遗传育种研究方向：油菜细胞遗传学获得学位名称：农学硕士获得学位时间：2013年6月20日华中农业大学植物科学技术学院二O一三年六月 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文是否保密龟如需保密，解密时间年月曰独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书丽使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同2-．作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。研究生签名：氧娃娃时间：为B年6月1日学位论文使用授权书本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换服务，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。注：保密学位论文(即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论文)在解密后适用于本授权书．学位论文作者签名：恕娃娃导师签名：彩磅签名日期：为马年易月1日签名日期：W哆年6月≥习 甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯iAbstract．⋯⋯⋯．⋯⋯．⋯⋯⋯⋯．．⋯．⋯．⋯．⋯⋯．⋯⋯．⋯⋯．⋯．⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯．⋯．．⋯．．⋯⋯．⋯．⋯．⋯．．iii1．文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．1菌核病概况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1．1菌核病的研究现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．1．2核盘菌生长的影响因子⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．1．3核盘菌致病过程和机理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21．2油菜菌核病的防治措施⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．2．1栽培管理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．2．2化学农药⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．41．2．3生物防治⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一41．2．4抗病育种及分子机理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51．3木质素研究概况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．3．1木质素的结构及合成途径⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．51．3．2木质素在植物抗菌核病中的应用研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．71．3．3木质素的其他应用研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．81．4荠菜在植物育种中的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．5本研究的目的和意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．实验材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一92．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．2实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．2．1小孢子培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．92．2．2有性杂交及自交⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112．2．3茎尖培养、快繁及幼苗的加倍⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．2．4木质素含量测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．2．5石蜡切片制作⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．2．6徒手切片制作⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯173．结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文3．1小孢子培养情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．193．2有性杂交及自交结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一193．3茎尖培养及加倍效果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．193．4木质素含量测定结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．193．5茎秆横切面解剖结构⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．203．6石蜡切片⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．224．讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．334．1杆硬材料689加倍效果不理想的原因分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．334．2木质素含量测定及染色方法的不足⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．334．3木质素在植物组织中的分布及其作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．34参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36附勇之⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．46致{射⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48H 甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究摘要菌核病是我国油菜三大病害之一，严重影响着我国油菜的产量和品质，在我国每年造成的损失达到了50／o~30％。因此，油菜菌核病的综合防治和抗病育种研究越来越受到科学家们的关注。目前，关于油菜对菌核病的抗病机理的研究有很多，其中，木质素作为植物的一种结构性物质在植物抵抗真菌侵染时起到了很重要的作用。本研究在荠菜Capsellabursa-pastoris(L．)Medic(2n=4x=32)与甘蓝型油菜Brassicanapus但n=38)的杂交后代中发现了一株硬杆材料(编号为689)，经测定其茎秆中木质素含量比对照中油821高20％，且经核盘菌接种实验证实其对菌核病是有一定抗性的。本研究通过小孢予培养、木质素含量测定及石蜡切片等技术对上述新材料进行了纯化，并希望通过其与高感品种WestarDH系杂交构建一个作图群体来初步定位该新材料中与木质素合成途径相关的基因，同时探究了该硬杆材料与对照中油821不同时期不同组织中的解剖结构差异性，这对于油菜的抗病育种具有重要意义。主要结果如下：1．通过小孢子培养已经获得硬杆材料689的DH系，在秋水仙素加倍过程中发现该材料的加倍效果很差，分析原因可能是689植株中木质素含量高而阻止秋水仙素进入组织内从而影响染色体加倍。2．对689、中油821及荠菜等材料的叶片、叶柄进行木质素含量测定，发现荠菜叶片、叶柄的木质素含量最高，689叶片木质素含量比对照中油821高15％左右，而叶柄却比中油821低。3．成熟期徒手横切距离地面25cm处的茎秆组织并用间苯三酚染色观察解剖结构差异，发现木质素在689茎秆中维管系统的横向分布范围更广，同一植株由根部到顶部的茎秆横切结构也有明显差异，从根部到顶部，木质素含量越来越少。4．石蜡切片结果表明：子叶期时，木质素在689下胚轴的横切面中分布区域比中油821广，且两材料中维管束的大小和排列有明显差异，689中维管束的直径大、排列较松散；而中油821中维管束的直径小、排列紧密。而在根中却得到相反的结论，木质素在中油821根中的横向分布区域比689广且染色也更深。5．苗期时木质素在689与中油821茎秆中横向分布的差异与徒手切片结果是 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文一致的，且在苗期叶片、叶柄中也得出相同结论。盛花期时，689的花药壁观察有木质素的分布而中油821中没有，而在花柄、花萼、花瓣和子房中，木质素在689中的分布比中油821多。结荚期时，木质素在689果柄中维管束的分布范围更广，且发现中油821的皮层比689要厚很多。关键词：菌核病；木质素；小孢子培养；石蜡切片；木质素含量测定 甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究AbstractThesclerotiniasclerotiorumisoneofthethreediseasesofrapeseedinourcountry．Itseriouslyaffecttheyieldandqualityofrapeandhascausedalossabout5％一30％everyyear．Therefore，researchersgetmoreattentiontothestudiesaboutthecomprehensivecontroltothesclerotiniasclerotiorumandthedisease-resistantbreeding．Atpresent，therearemanystudiesaboutthedisease—resistantmechanismofrapetothesclerotiniasclerotiorum，andligninasastructuralmaterialhasplayedaveryimportantrolewhenplantscope诵t}ltheinfectiontothefungi．Inthisstudy，Ahardstalkmaterial(named689)isfoundinthehybridsofCapsellabursa-pastoris(L．)Medic(2n24x532)andBrassicanapus(2n=38)，itindicatesthatthelignincontentinthestemofthematerialis20％higherthanthatofthecontrastzhongyou821，andthefungalinoculationexperimentsconfirmedthatithascertainresistancetosclerotiniasclerotiorum．Thisstudyhaspurifiedthenewmaterialandhasexploredtheanatomicaldifferencesinthetissueofthenewmaterialandthecontrolzhongyou821atdifferentdevelopmentalphasethroughthemicrosporeculture，thedeterminationoflignincontentandtheparaffinsectioneta1．．Atthesametime，wehopetoconstructamappingpopulationtolocatethegeneinvolvedintheligninsynthesispathwayinthenewmaterialviathehybridizationbetweenthenewmaterialandtheWestarDHlineswhichishighlysusceptibletothesclerotiniasclerotiorum，thesearegreatsignificanttothedisease—resistantbreedingofrape．Themainresultsweredescribedbelow：1．WehaveobtainedtheDHlinesofthehardstemmaterial(689)throughthemicrosporecultureandwefoundthedoubleeffectofthenewmaterialWasverypoorwhencoped、析tllcolchicine．Thereasonmaybethatthehighcontentofligninin689Canpreventthecolchicineenteringintotheorganizationsofplantandthenaffectthechromosomereduplication．2．Intheexperimentofthedeterminationoflignincontentoftheleafandpetioleof689、zhongyou821andCapsellabursa-pastoriseta1．，wefoundthatthelignincontentoftheleafandpetioleofCapsellabursa-pastorisWasthehighest,thelignincontentofleafin689Was15％higherthanthatofthecontrolzhongyou821，butinthepetiole，the 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文resultswerecontrary．3．Freehandsectionsofthestemof689andthecontrolzhongyou821wereexcisedatadefmeddistance25cmfromthegroundandstained、析廿1phloroglucinol-HCLtoobservetheiranatomicaldifferences．Resultsshowedthatthetransversedistributionoflignininthevascularsystemofthestemof689Waswiderthancontrol，andinthesameplant，thecrosscuttingstructureofthestemfromtheroottothetopalsohadsignificantdifferencesthatthedistributionoflignininthestemWaslessandlessfromroottotop．4．Paraffmsectionsshowedthatthedistributionoflignininthetransversesectionofthehypocotylof689Waswiderthanzhongyou821，andthesizeandarrangementofvascularbundlesinthetwomaterialsWassignificantlydifferent．Thediameterofthevascularbundlesin689Waslongerthanthatofzhongyou821andvascularbundlesin689werelooselyarrangedandthoseinzhongyou821werecloselyarranged．Wegottheoppositeconclusionintheroots，thetransversedistributionofligninintherootsofzhongyou821WaswiderandthedyeingofligninWasdeeperthanthatof689．5．Intheseedlingstage，thedifferencesinthetransversedistributionoflignininthestalksof689andzhongyou821wereconsistent谢廿ltheresultsofthefreehandsections，andwehavedrawedthesanleconclusionsintheleafandpetiole．Intheflorescencestage，wefoundthedistributionofligninintheantherwallof689，butnodistributioninzhongyou821，andintheflowerstalkandcalyx，petalandovary,thedistributionofligninin689Waswiderthanthatofzhongyou821．Inthepoddingperiod，thedistributionoflignininthevascularbundleofpedunclein689waswider’andthecortexofzhongyou821Wasmuchthickerthanthatof689．Keywords：Sclerotiniasclerotiorum；Lignin；Microsporeculture；Paraffinsections；Determinationoflignincontent 甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究1．文献综述1．1菌核病概况1．1．1菌核病的研究现状菌核病又称白霉病、茎腐病等，是由核盘菌Sclerotiniasclerotiorum(Lib．)deBary侵染导致的一种重大植物病害。核盘菌是子囊菌亚门，核盘菌属真菌，它的寄主范围非常广泛，可以寄生64科225属的383种植物，能侵染72科约400种植物，其中以双予叶植物居多(云南省烟草农业科学研究院2011)。除了危害十字花科植物以外，还可危害莴苣、甜菜、向日葵、柑橘、豆科植物等，引起菌核病(Purdy1979)，在我国，每年造成的经济损失达到了10～30亿元，病害严重的区域，产量减少50％左右。该病主要侵染植物的茎蔓、果实和叶片，使其逐渐腐烂坏死；在潮湿条件下，茎秆、角果和病叶的表面会密生白色的棉絮状菌丝体和灰色的鼠粪状菌核(李明桃2012)。油菜是我国重要的油料作物之一，而油菜菌核病严重制约着油菜的生长和增产，在我国，几乎所有的油菜种植区都有菌核病的发生，其中，长江流域和东南沿海地区的发病情况是最为严重的，发病率达到了100／o---80％，产量损失为50／o---30％(谈文等2003)。油菜菌核病的发病期主要是在开花期及花后一段时期(徐森富等2012)，这段时期内，油菜田间环境潮湿凉爽，适宜核盘菌的生长。L．H．Purdy在1979年的植物病理学系报告中指出核盘菌的适宜生长温度为肚32℃之间。由于核盘茵的寄主范围极其广泛以及其产生的子囊孢子和菌核能够在土壤中存活8年之久(BaeandKnudsen2007)，使得该病的预防与防治成为很大的难题，相关领域的科学家们一直都致力于这方面的研究，期望能够有所突破。1．1．2核盘菌生长的影响因子研究表明，温度、pH、光照等因素均会影响核盘菌的生长发育。其中，温度高低影响菌丝萌发产生子囊盘的数量以及菌丝的生长速度和活性。温度高时产生的子 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文囊盘数量多，温度低时产生的子囊盘数量少。菌丝的适宜生长温度为14--一28。C，低于10。C时，菌丝生长速度明显减慢；高于30。C时，菌丝生长一段时间后便会停止生长或老化枯死(高同春等1995)。宋超等(2007)研究表明pH和光照对菌丝的生长和菌核的萌发影响不是很大，但核盘菌更适宜在pH为5--一7的中性和偏酸性环境下生长。随着经济社会的发展，人类的活动已经严重破坏了我们赖以生存的地球，随着二氧化碳等温室气体的排放导致全球气候变暖，这不仅会影响植物的生长发育，也会影响病原体的生长和发育。Siebold和Tiedemann(2013)利用人工气候室和一种土壤变暖设施研究了气候变暖对核盘菌生长的影响，结果表明温度升高后，菌核萌发率达到了最大，子囊盘提早产生，从而加速了侵染过程。核盘菌的生长发育需要一定的碳源和氮源等营养物质。马国良等(2012)通过研究青海春油菜菌核病菌在不同碳氮源的生长条件下，菌丝生长及菌核形成的情况，证明了菌核病菌菌丝生长适宜的碳源为可溶性淀粉和果糖，适宜的氮源为柠檬酸铵和硫酸铵，碳氮比为30：1。Liberti等(2013)研究证明在低等真核生物中，乙醛酸循环能够让细胞在缺乏单糖情况下利用二碳化合物。在丝状真菌中，乙醛酸代谢与脂肪酸B．氧化是同时进行的，且这两个反应都定位于过氧化物酶体中。B．氧化过程中产生的乙酰辅酶A通过细胞液转运到线粒体中以供后续的代谢反应。1．1．3核盘菌致病过程和机理核盘菌侵入寄主植物时有两种方式，一种是通过萌发的子囊孢子侵入，另一种是通过子囊孢子和菌核所形成的菌丝侵入，其中后者为主要方式。DeBary(1887)的实验首先表明，核盘菌的子囊孢子只有在营养物质充足的情况下才能形成附着胞侵入寄主。核盘菌侵染植物时，会形成单附着孢或者复合侵染垫，然后形成菌丝直接侵入叶片表面(Akutsuetal1983；EmmettandParbery1975；Purdy1958；TariqandJeffries1984)。要想成功侵入植物体内，菌核病菌首先会产生少量角质酶来分解寄主的角质层(朱小惠和陈小龙2010)。侵入植物体内后，核盘菌会释放大量的草酸和水解 甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究酶类来抵抗植物的物理防御机制，并从中获得营养物质(CollmerandKeen1986；Godoyetal1990)。果胶酶和多聚半乳糖醛酸酶PG(Polygalacturonase)被认为是与核盘菌致病力密切相关的细胞壁降解酶，它们能够迅速降解寄主细胞壁的组成成分从而为核盘菌的生长提供相应的碳源(Lumsden1976)。此外，纤维素酶、半纤维素酶、磷脂酶、木质素降解酶和蛋白质水解酶类等都与核盘菌的致病力有关(罗宽和周必文1994)。很多研究者已经证明草酸在核盘菌的生长以及致病机理中起着非常重要的作用(Donaldsonetal2001；Godoyetal1990；Kesarwanietal2000；RollinsandDickman2001；ZhouandBoland1999)。它是丝状真菌分泌的一种强有力的毒性有机物质，能够降低周围环境的pH值，创造适宜核盘菌侵染的条件。草酸还能够螯合钙离子形成草酸钙，影响细胞壁中果胶聚合物的稳定性，从而使真菌分泌的果胶酶能够更容易降解细胞壁(Yadavetal2012)。水杨酸是植物中一种重要的防御信号分子，核盘菌在侵染植物的时候会将其降解(PennandDaniel2013)这也是核盘菌致病的一种机理。1．2油菜菌核病的防治措施1．2．1栽培管理对油菜进行适当的田间管理可以有效预防菌核病的发生。费维新等(2002)研究了2个甘蓝型油菜品种在不同播期和不同密度下菌核病的发病情况，结果表明合理密植可以提高油菜的产量，适当晚播和选择抗(耐)性品种可以避开或有效控制油菜茵核病的发生。在一块田地上实行作物轮作以及对土壤进行烟熏的方法也可以有效防治菌核病(Fr6esetal2012)。在油菜盛花期、终花期摘掉黄、老、病叶可以有效控制菌核病的流行(翟宗清等2009)。黄涛等(2012)研究表明对油菜施用腐熟农家肥相对于施用尿素、复合肥，可以提高植株对菌核病的抗性。分析原因是腐熟农家肥中含有一定量的微量元素、抗生素和大量有机质(秦伯强2009)。 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文1．2．2化学农药化学农药以其见效快、成本低等优点成为防治油菜菌核病的主要手段，目前使用比较多的有多菌灵、乙霉威、菌核净、腐霉利、嘧菌酯、咪鲜胺等(秦虎强等2011：张夕林和张谷丰1999)。由于农药的大量使用，核盘茵在发病严重地区逐渐产生了抗药性(石志琦等2000)，因此化学防治效果有限而且对环境污染严重。1．2．3生物防治生物防治是利用生物个体之间的拮抗、重寄生、竞争、诱发抗病性和交叉保护等特征来控制病原体(牛伯庆等2011)。与传统化学农药相比，生物农药更加环保，不会有残留问题，对人畜都很安全(InbarandChet1996)，且如果在始花期和初花期就利用生防菌进行防治，那么防治效果会比盛花期好得多，劳动强度也相对减小(张夕林等2003)。目前，随着大家环保意识的加强和生物科学技术的飞速发展，生物农药领域的相关研究也获得了突破性进展。现在研究的比较多的生物防治菌种主要有盾壳霉、木霉、假单胞菌等(牛伯庆等2011)。植物性病原真菌(包括核盘菌)的细胞壁的主要成分为几丁质、葡聚糖和蛋白质(Jones1970)。Fr6es等(2012)研究发现某种链霉菌株的次级代谢产物中具有四种能够降解核盘菌细胞壁的酶_}、切几丁质酶、内切几丁质酶、葡聚糖酶和多肽酶，从而不可逆转的抑制了核盘菌的生长，从而可以作为一种很好的菌核病防治试剂。芽孢杆菌也是目前研究的比较多的一种生物防治细菌，它可以产生多种抗生素、芽胞和酶类物质(OngenaandJacques2008)。它在防治植物病害过程中起作用的主要活性物质是脂肽类化合物，包括伊枯草菌素(Iturin)、表面活性素(Surfactin)、和泛革素(Fengycin)(Stein2005)。伍辉军等(2012)从枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)G4菌株和解淀粉芽胞杆茵(Bacillusamyloliquefaciens)B3菌株中分别提取脂肽类化合物，将其配制成脂肽类生物农药乳油，结果表明这两种农药乳油均能显著抑制核盘菌的生长。4 甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究1．2．4抗病育种及分子机理目前，国内外专家学者对油菜菌核病的发生流行规律以及预防防治等方面做了大量的研究工作，在化学及生物药剂、田间栽培管理等方面也取得了一定的成绩，但是并没有从根本上改变油菜菌核病带来的危害局面。因此，科学家们越来越重视抗(耐)病品种的选育与利用，通过长时间的抗原筛选，诱导抗性，杂交育种以及转基因技术的采用，在高抗(耐)病品种的选育方面已经取得了很好的成绩。Kesarwani等(2000)将金针菇中控制草酸脱羧酶的基因通过分子克隆的方法转入烟草和西红柿中，在其体内过表达可以提高烟草和西红柿抵抗真菌感染的能力。陈晓婷等(2011)研究证明拟南芥细胞色素P450基因家族中的CYP76C2基因在拟南芥植株中过表达可以增强其对菌核病的抗性。且在这之前的实验中，他们发现核盘菌的致病因子——草酸能够诱导该基因的表达(陈晓婷2008)。Ramegowda等(2013)发现在干旱胁迫下正常生长的植物能够很好的抵抗核盘菌的侵染，原因是经过干旱逆境处理后的植物体内产生了很多活性氧，而这些活性氧与植物的抗病性是高度相关的。植物受到核盘菌侵染时会释放多聚半乳糖醛酸酶阻抑蛋白(PGIPs)来抑制多聚半乳糖醛酸酶(PGs)的活性(DeLorenzoetal2001；Zuppinietal2005)。Bashi等(2013)在甘蓝型油菜转基因植株中发现多聚半乳糖醛酸酶阻抑蛋白(PGIPs)可以抑制多聚半乳糖醛酸酶(PGs)的活性以及组织的坏死并延迟症状的出现。1．3木质素研究概况1．3．1木质素的结构及合成途径木质素是维管植物次级细胞壁中一种重要的结构物质，它是由苯丙烷类化合物聚合而成的酚类多聚体(Boerjanetal2003)。它有三种单体，分别为：松柏醇(coniferylalcoh01)，芥子醇(sinapylalcoh01)和对一香豆醇(p-coumarylalcoh01)(Boerjanetal2003)。双子叶被子植物中的木质素主要为愈创木基木质素(guaiacyllignin，简称G型)和紫丁香基木质素(syringyllignin，简称S型)，分别由松柏醇和芥子醇聚合而成，且这两种木质素有5种以上的连接方式(DavinandLewis1992)。 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文裸子植物通常都含有对一羟基苯基木质素(hydroxyphenyllignin，简称H型)，由对-香豆醇聚合而成，但主要还是以G型木质素为主(Baucheretal2003；Boedanetal2003)。植物中木质素单体的合成途径已经探明(图1)(Bayindiretal2008；Vanholmeetal2008)。L-苯丙氨酸骂肉桂酸三!L对香豆酸L-phenylalanineCinnamicacidp-CoumaricacidJ，4CL黄酮阿魏酰辅酶A．CCoAOMr一咖啡酰辅酶÷旦盟对香豆酰辅酶A—_爨耋望Feruloyl．CoACaffeoyl-COAC3Hp-Coumaroly．COA传真．暴CCR』c源5．羟基松伯醛．‘旦旦一松伯醛对香豆醛5．HyroxyConiferaldehyde’一iC。MT一如芥子醛松伯醇SinapaldehydeConiferylalcohoI、ICADl慧勰：黧。Ir5_u^Ma·坼，La∞oo口si煮i烹⋯愈疮莱塞木质素(G型)s。旧p叫8I∞hol≮麓鑫需；：≯示、u芏7l过氢R,蝴li膝酶lPeroxidase&蝴s∞紫丁香木质素(s型)Syringyllignin旷嘶帅iar撼al'''oenvae篡。对．羟苯基木质素(H型)图l木质素的合成途径Fig．1LigninsynthesispathwayFigLignmsynthesispathway●由图中可以看出木质素的合成是从苯丙氨酸解氨酶(PAL)催化苯丙氨酸产生肉桂酸开始的。从苯丙氨酸到木质素单体的合成途径中共涉及到10个酶：苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸．4．羟基化酶(C4H)、4．香豆酸：辅酶A连接酶(4CL)、莽草酸／奎宁酸羟基肉桂酰转移酶(HCT)、香豆酸．3．羟基化酶(C3H)、啡酰辅酶A氧甲基转移酶(CCoAOMT)、阿魏酸．5．羟基化酶(F5H)、咖啡酸氧甲基转移酶(COMT)、肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)、肉桂醇脱氢酶(CAD)。单体合成之后就被转运到细胞壁中进而被氧化生产相应的木质素(Ralphetal2004)。 甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究目前已经有很多研究学者通过调节木质素合成途径中某些关键酶的活性来控制木质素的合成。Guo等(2001)在转基因苜蓿中发现下调咖啡酸氧甲基转移酶(COMT)的活性，会使G型木质素的含量降低，S型木质素几乎全部丢失；下调咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶(CCoAOMT)的活性，会使G型木质素含量下降而S型木质素含量不变。1．3．2木质素在植物抗茵核病中的应用研究Dixon和Paiva(1995)研究表明苯丙烷类代谢途径是植物抵御非生物和生物胁迫的重要组成部分。由此可见，木质素也具有抵御逆境胁迫的生物学功能。Guo等(2001)研究者也证明了木质素可以增强植物茎秆的机械强度，提高植物细胞运输水分的能力，增强植物的抗倒伏性以及抵御病原菌微生物的侵染。当植物受到机械损伤以及病原体入侵时便会大量聚积木质素或者木质素类似物(Boudetetal1995；DixonandPaiva1995；NicholsonandHammerschmidt1992；Vanceetal1980)。木质素在修饰细胞壁的机械特性方面有很重要的作用，它通过增加细胞壁的硬度来限制毒素从病原体到宿主以及营养物质从宿主到病原体的扩散，同时限制了外源酶对宿主细胞壁多糖的降解(Ride1978；WengandChapple2010)．已经有研究证明细胞壁的木质化可以增强一些草本和木本植物的抗真菌特性(Dushnickyetal1998；HammerschmidtandKuc’1982；SouthertonandDeverall1990)。虽然关于疾病诱导后合成的木质素中相关基因被激活的的分子机理以及木质素沉积的时间和空间调节机制都不是很清楚，但是似乎在压力胁迫下如病原体入侵，可以改变木质素的组成即单体的比例(Gayosoetal2010；Hammerschmidtetal1985；Pomaretal2004；RosBarcelo1997；SouthertonandDeverall1990)。Eynck等(2012)通过比较研究发现亚麻芥抗病和感病材料中肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)的组成型转录水平和基因调节模式有显著差异。抗病材料在接种核盘菌之后，会诱导CsCCR2基因的表达从而导致G型木质素的增加，而在健康茎秆组织中高水平CsCCR4基因的组成型表达会使S型木质素含量很高。CCR基因家族的这种组成型和诱导型表达均减缓了抗病材料病症的发展。 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文1．3．3木质素的其他应用研究在造纸行业中，木质素决定着植物制浆的特性。在纸浆纤维中严格控制木质素的含量是为了平衡纸张的强度和其光学性质，在制浆过程中去除木质素是很昂贵的也是对环境有害的(Odendahl1994；Biermann1996)。因此在制浆领域，许多研究者都期望能够降低树木中的木质素含量。木质素的含量和组成还可以改善饲料的可消化性(WhettenandSederoff,1991；BoudetandGfima-PeRenati，1996；Dixoneta1．，1996)。木质素含量随着饲料茎秆的成熟而逐渐增加，包括豆科植物如苜蓿(Jungetal1997b)和草类如牛尾草(BuxtonandRedfeam1997)。且随着茎秆的进一步成熟，木质素的组成也会发生变化——S／G比例显著提高(BuxtonandRussell，1988)。相关科学家已经证明了木质素的含量(Albrechtetal1987；Casler1987；Jungetal1997a)与S／G比值(Sewaltetal1996)与饲料的可消化性是成负相关的。木质素在植物燃料方面也有相应的研究需求。科学家们已经证明了，在很多作物中通过下调木质素合成过程中相关基因的表达能够改善植物中糖化作用的效率和纤维素乙醇的产量(ChenandDixon，2007；Dienetal2009；Saballosetal2008)，这些作物包括转基因柳枝稷(Fuetal2011；Saathoffetal2011；Xuetal2011)和甘蔗(Jungetal2012)。1．4荠菜在植物育种中的应用荠菜Capsellabursa-pastoris(L．)Medic(2n=4x=32)，是十字花科荠菜属一、二年生草本植物。株高20．50cm，茎直立，有分枝，稍有分枝毛或单毛；基生叶丛生，呈莲座状，具长叶柄；以白花授粉为主，在全世界都有分布；在中国和其他许多国家，人们传统上都把它当作一种蔬菜和药用植物(Zhou1987)。研究表明荠菜菜籽油中芥酸的含量显著低于其他十字花科植物(Park1967)，且它对油菜黑斑病和菌核病表现出高度抗性(Cormetal1988；SigarevaandEarle1999；Chenetal2007)；也有研究者证明它能够忍受寒冷、盐和干旱(Liuetal2004a)。因此，科学家们可以将荠菜这些比较好的农艺性状通过远缘杂交或者转基因等方法转 甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究入芸薹属作物中。Sigareva和Earle(1999)将荠菜和甘蓝进行了体细胞杂交，但是由于杂种不育而没有得到后代植株，进而限制了后面的育种进程。Chen等(2007)将荠菜分别与白菜和甘蓝型油菜进行有性杂交，第一次报道了后代植株的形态学与基因组学特性。1．5本研究的目的和意义本研究运用石蜡切片和徒手切片的方法观察了木质素在抗菌核病新材料和对照中油821中不同时期不同组织中的分布情况的差异，同时采用Thioacidolysis(硫酸解法)测定了抗病材料与对照的叶片、叶柄中木质素的含量，探讨了木质素作为植物中的一种结构性抗病物质在植物对抗菌核病时所起的作用，并期望利用该材料与另一高感品种Westar作为亲本来构建群体，利用分子标记等方法初步定位该材料中与木质素合成相关的基因，这对于油菜的抗病机理研究提供了新的见解和理论基础，对油菜的抗病辅助育种具有十分重要的意义。2．实验材料与方法2．1实验材料Chen等(2007)将甘蓝型油菜(Brassicanapus，2n=38)与荠菜(Capsellabursa-pastoris(L．)Medic，2n=4x=32)进行有性杂交，在其后代群体中发现一株硬杆材料(茎秆木质素含量比中油821高20％)，且对菌核病有一定抗性，将这一新材料编号为689。实验中用到的另一个亲本是高感品种WestarDH系(由王晶老师提供)，对照用的是中油821。2．2实验方法2．2．1小孢子培养(实验中用到的培养基配方见附录)1)取材取材时间为天气晴朗的上午8：00．10：00点之间，(经验表明在此时间段取材有利于出胚，如果温度在15—20。C之间，下午也可以取材)；取材的部位：选取主花9 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文序的花蕾，该花序有以下特点：A)主枝花序对于出胚率很重要(主花序花粉活力强，小孢子的发育时期较一致)，选主枝花序已开花，且开花的朵数在1．10朵之间，开3．5朵花的主花序的花蕾出胚率相对较高，但不同材料之间存在差异。B)在选花蕾时，不要选柱头露出的和花蕾裂开的，以免灭菌不彻底。C)如果没有合适的主花序可取，可以取侧枝的花蕾，但一定要选取距主花序最近的侧枝。D)如果遇到阴雨天气，为了不影响实验进程也可以取材，但一定要选取生长良好的花序，因为有研究报道低温有利于小孢子的胚胎发生(尽量避免雨天取样)2)选蕾在实验室选取长度为2．5．3．5mm的花蕾，如果是侧枝，则花蕾的长度需要稍大一些，即3．5．4．0mm之间(选蕾时最好用刻度尺量取长度)。在选蕾时要注意看清楚花蕾是否有被虫啃食的现象，若有，则丢弃该花序，以防污染。注释：A、甘蓝型油菜花序一般选取大小在2．5—3．5mm之问的花蕾，但是不同的油菜品种发育时期不尽相同，可以剥蕾挑取小孢子进行镜检以确定恰当发育时期(最佳时期为单核靠边期)；B、选蕾以后如果不能立即进行小孢子的提取过程的话，应将花蕾放置于湿润的条件下低温保存3)消毒准备好75％的酒精，O．1％升汞，两只已灭菌的三角瓶(如果做两朵花序的)，两瓶无菌水，一套抽提工具，B5提取液，N13液体培养液，N16液体培养液。选取的花蕾用75％的酒精消毒30-40S(注意消毒时间不超过lmin)，然后用升汞消毒10—15min(一般12min)，最后用无菌水清洗3次，每次5min(第一次时间可以稍短一些)。在用升汞消毒过程中可以烧镊子，无菌水洗的过程中可以拆工具包。4)抽提花粉及胚诱导培养A)将灭过菌的花蕾放置于玻璃管中，加入1-2滴(可以根据花粉大小调整)B5液体培养基，用玻璃棒捣碎，使花粉散出，研磨至糊状，在管中加入半吸管B5，导入过滤器过滤，花粉滤液盛入10ml离心管B)用滴管吸B5抽提液冲洗过滤器中的花粉，冲洗2—3次后，在10ml离心管中将花粉悬浮液稀释至10mlC)将花粉悬浮液离心，800r／min，离心5min10 甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究D)将离心管中的上清液倒入废液缸中，再向离心管中加入B5培养基10ml(如果加培养基的时候不小心将培养基滴到离心管外壁，立即在酒精灯上烧一下)，并将沉淀的花粉用滴管冲散，再次悬浮离心(用封口膜封口)，800r／min，离心5min后，倒掉上清液E)向离一t3管中加入N13培养基2-3ml左右(具体加多少根据花粉量和需要分皿量的多少来定)，稀释后的悬浮液平均分装入7．5cm培养皿(每皿大约含1．5．2个花蕾)，再向培养皿中加入N13培养基至5ml左右(5滴管左右)，用封口膜封口，25。C暗光条件下培养，大概10天左右颗粒状胚的形成，如果没有则继续培养，如果有可见的胚出现，则移至50r／min、25℃恒温摇床上继续进行暗培养。5)再生苗培养A)将暗培养获得的子叶形胚移入B5固体培养基，于20。C，16hr光／8hr暗光，2000LUX光强条件下培养，进行再生苗的诱导B)进行再生苗诱导培养的胚一般15d左右换一次培养基进行继代培养，具体的时间依据胚在培养基中生长状态决定，继代1．2次直至长出再生植株C)长出再生植株继续在B5固体培养基上培养，依据生长状态定期进行继代6)移栽及浸根加倍获得的再生苗一般在10月中旬开始移栽到大田，移栽时先要洗尽根部的培养基，然后移栽至穴盘里，浇足水，大概半个月后挖出幼苗，洗净根部的泥土，用100medl秋水仙素浸根6h进行加倍，再移栽至大lit，移栽后要立即浇足定根水，用遮阳网覆盖，一般白天覆盖，晚上打开，直至移栽的再生苗成活，然后按照一般的大田管理进行管理。2．2．2有性杂交及自交小孢子培养得到的689单倍体在田间加倍效果不佳，花药上几乎没有花粉，因此只能作为母本与高感品种OroDH系进行杂交，且每株剥的花蕾数要足够多才能保证有一定数量的杂交种子，选择晴天的中午12：00．14：00进行授粉工作，并选择有花粉的植株进行套袋自交。 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文2．2．3茎尖培养、快繁及幼苗的加倍(超净工作台上完成)由于689加倍效果不好，为防止其不结实而丢失，故做茎尖培养以保存材料，并在培养基中进行加倍。基本程序如下：1)取幼嫩的基部分枝，以每个腋芽切成一段，先用75％乙醇处理1分钟，再用0．1％的氯化汞处理15分钟后用无菌水洗三次，每次5分钟。2)切除两端接触过消毒液的断面，插入新鲜的MS培养基中。3)待幼苗从腋芽中长出后将其转到添加有1．5％6．BA和0．25％NAA的MS培养基中快繁。4)快繁来自每个组合的幼苗使其达到一定的数量，将幼嫩的小苗转入添加有lOOmg／L秋水仙素的快繁培养基中培养7—15天左右，具体时间视苗子的长势定。5)当幼苗的顶端明显变粗时即可停止处理，将处理的幼苗连同愈伤组织一同转入新鲜的快繁培养基中直到从愈伤组织中分化出新苗。2．2．4木质素含量测定(参照彭良才老师实验室)2011年11月15日，取689、中双11、中油821(倒数第5片叶)和荠菜的叶片、叶柄在烘箱中烘干后，用液氮将其研磨成粉末状装袋放烘箱里备用，每个样品测三次重复。具体测定方法如下：1)称取0．50009烘干后的叶片或叶柄W1(约0．59)，用定性滤纸包好，放入索氏提取器中用苯一乙醇(67：33)于沸水中通过抽提4h，提取完成后将抽提后的秸秆在通风橱中风干。2)解开滤纸包，将风干后试料小心转入250ml三角瓶中，加入lOml72％的浓硫酸，30。C115rpm震荡1．5h，然后加入200ml蒸馏水，115℃灭菌1h。过滤，并用蒸馏水洗，确保硫酸完全洗去，将滤液定容至V=250ml，此时硫酸浓度为2．88％3)将过滤后的残渣和砂芯漏斗一起干燥(80。C)，在干燥器中冷却至恒温后，称重得W2。4)将残渣在200。C烧30min，然后在5754-25。C烧马氏炉上灰化4h，干燥器中 甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究冷却30min，称重得W3。5)得出酸不溶木质素的含量为：％AIL=(W2．w3)木100／Wl6)将步骤3所得V=250ml的滤液用2．88％的硫酸稀释10倍(视样品而定)，保证吸光度在O．2．0．7之间，稀释倍数记为D，光波长为205am．以2．88％的硫酸为对照。7)所得酸溶木质素的含量为：％ASL=(A*D*V／1000*K'W)*100A表示：吸收值，D表示：稀释倍数，V：滤液的总体积K表示：酸溶木质素的吸收系数，取110W表示：试样的绝干质量8)样品中木质素的含量为：Lignin(％)=AlL(％)+ASL(％)2．2．5石蜡切片制作I．取材实验中主要对硬杆材料689和对照中油821进行石蜡切片制作，分为几个不同时期进行取材分别是：子叶期：将两种材料的种子同时在培养皿里发芽生长一周，取下胚轴和根部(中间段)约10mm长。苗期：材料在大田里生长约3个月左右，取叶片、叶柄和茎秆，选择大小基本一致的叶片，茎秆选取的是基部倒数第五节，其中叶片切成2～5mm的小段，叶柄和茎秆纵向分割成1／4小块，3～5mm长的小段。盛花期：材料在大田里生长约6个月左右，取茎秆和花蕾，茎秆为距离地面64cm处，花蕾为主茎上距离地面140cm处的花序，其中茎秆纵向分割成1／4小块，3～5mm长的小段，花蕾不分割直接固定。结荚期：材料在大田里生长约7个月左右，取角果、果柄和种子，其中角果切割成3～5mm长的小段，果柄切割成约10mm长，种子直接固定。 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文II．组织固定和包埋本实验所用的固定液为FAA(Formalin．aceticacid．alcoh01)固定液，具体配方见表1表1FAA固定液的配置Table1TheformulaofFAAfixationliquid注：福尔马林为浓度37％的甲醛水溶液，根据固定材料不同选用不同浓度的FAA。一般固定幼嫩的材料选用50％的FAA，如小花、分生组织等；其他比较老的材料选用70％的FAA。第一天：组织固定取新鲜材料投入装有2／3体积固定液的10mlPA瓶中，然后在隔膜真空泵(型号GM一1．0A)中进行真空抽气。缓慢抽气冒气泡后保持真空15分钟后缓慢放气，如此数次至材料沉底即可，以达到快速彻底固定。换新鲜固定液，4。C过夜。对于成熟期固定的茎秆、角果、果柄和种子等较硬的组织可以先用氢氟酸进行软化，再进行后续操作，具体方法如下：先经70％乙醇、50％乙醇、30％乙醇各1小时逐级降至蒸馏水，然后在15％氢氟酸中软化10～15天，软化结束后先用自来水流水冲洗24h，再用蒸馏水浸洗6h。14 甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究第二天：脱水，具体流程见表2表2脱水流程Table2Theprocessofdehydration(各系列乙醇均用蒸馏水稀释无水酒精配置，组织可在70％乙醇中存放几个月)第三天：进一步脱水、透明和包埋，具体流程见表3表3脱水、透明和包埋流程Table3Theprocessofdehydration，clearingandembedding第四天：继续包埋将材料置于42。C直至碎蜡完全熔化。再加约1／4体积的碎蜡至完全熔化后移至60。C。几个小时后换上新鲜熔好的蜡液，过夜。 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文第五天：继续包埋换蜡一次第六天：继续包埋换蜡一次第七天：继续包埋换蜡一次第八天：固定组织于蜡块中组织浸蜡达到饱和程度以后即可包埋。事先要准备好包埋盒，选用底面光滑、有一定硬度的纸折叠成纸盒(李和平和龙鸿2009)，并在纸盒的侧面写上材料编号。将熔解的石蜡(温度不能太高，一般控制在70—80。C左右，否则容易烫伤材料，造成材料变形)倒入准备好的包埋盒，再将经石蜡浸透的组织迅速倒入盒中，调整材料的位置，若发现石蜡已经开始凝固了则不要再移动材料。包埋好后则不要移动包埋盒，让其冷却一晚上即可。此步对得到理想的组织切片有很大影响，因此包埋的时候动作要快，一次操作的材料要少，以免来不及包埋，每个小盒的材料摆放整齐、稀松，便于修蜡块。III．切片首先将蜡块进行分割、修整(李和平和龙鸿2009)，蜡块修整成梯形以便固着牢固(注意上下表面要修成矩形且两面相互平行这样才能确保切片的时候蜡带是直的)，然后将修好的蜡块固着在2ml离心管上(盖上事先粘有蜡块)。实验用到的切片机为Microm全自动半薄切片机(型号HM360)，刀片用的是Leica819钢刀，切片厚度为8um。切片时可以先切12um，便于成蜡带，等到切到材料时，再调到8um。Ⅳ．展片与粘片本实验所用载玻片为世泰高品质显微镜载玻片，无需清洗，可以直接使用，用到的粘贴剂为蛋清甘油，配置方法为：将新鲜鸡蛋一端打开一个小孔，只让蛋白慢慢流入烧杯内。用洁净的玻璃棒充分调拌成泡沫状，然后用双层纱布过滤至量筒中，经一昼夜能滤出透明的蛋白液。再加入等量甘油及少量防腐剂(如樟脑精)振荡使其完全混合后即可应用，不用时需放在4*C冰箱中保存。 甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究首先准备展片台(KD．H烘片机)，接通电源，打开电源开关，调节温度至35。C。展片前需在载玻片上涂一层蛋清甘油(量不能太多)，然后再滴加数滴蒸馏水，用平头镊子将切出的蜡带漂浮在有水的载玻片中部，亮面朝下，并标明编号，再将其放至展片台中展片。展片完后可以用吸水纸吸去载玻片中多余的水分，然后放至展片台上继续烘烤至无明显水渍。再将烘好的切片转移至摊片盘中，然后将摊片盘置于37℃温箱内烤数天即可烤干。V．脱蜡与染色实验中用到的脱蜡试剂是二甲苯，盛试剂的容器用的是立式染色缸，染色剂是间苯三酚(浓度为59间苯三酚溶于100ml95％酒精中)，并用浓盐酸进行显色。由于间苯三酚溶于乙醇，所以染色后并未经各级酒精进行脱水及后续的透明和封藏，而是直接进行封片观察并拍照，所以本实验制作的石蜡切片不能长期保存。基本步骤如下：1)脱蜡：用镊子将制备好的切片放至装有二甲苯的立式染色缸中，脱蜡10min。2)复水：％--甲苯／％无水乙“无水乙醇◆无水乙醇◆95％乙“85％7,醇◆70％乙醇◆50％7,醇◆30％7,醇◆蒸馏水，切片在每级试剂中停留4～5s。3)染色：在间苯三酚中染色2min，然后用浓盐酸显色lmin。4)封片：采用的封片剂是甘油和浓盐酸的等体积混合液，每片滴加25ul。盖玻片采用的是世泰高品质显微镜盖玻片(24×50mm)。5)拍照：用正置荧光显微镜(NikonEclipse80i)进行观察并拍照。2．2．6徒手切片制作2012年5月18日(植株生长约7个月)，在689和中油821材料中选取株高一致的两株，取离地面25cm处的茎秆进行横切，然后用1％间苯三酚(溶于95％酒精中)进行染色2min，再用浓盐酸进行显色lmin，最后用数码相机进行拍照。2013年3月11日(植株生长约5个月)，在689和中油821材料中选取株高一致的两株，从根部到植株顶端依次选取5个部位(如图2所示)进行横切，然后用5％间苯三酚(溶于95％酒精中)进行染色2min，再用浓盐酸进行显色lmin，最后用数码相机进行拍照。 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文图2：成熟期徒手切片取材部位。A：中油821；B：689，①②③④⑤为植株茎秆根部到顶端依次取材的部位。Fig．2：Theexcisedpositionoffreehandsectionsinmaturityperiod．A：zhongyou821；B：689．①②③④⑤respectivelyfortheexcisedpositionofthestemfromroottothetop．18 甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究3．结果与分析3．1小孢子培养情况通过小孢子培养获得DH系的材料有：中油821；中双11；165(硬杆)；168(黄籽)；755(白花)；756(硬杆)；689(硬杆，双低)。3．2有性杂交及自交结果加倍效果不理想的689材料中有一株套袋自交获得种子(编号689．3)于2012年7月份拿到青海夏繁。开花期以689作母本与westarDH系进行杂交，结果每株仅获得少量种子，由于杂种数量有限不能用来做小孢子培养构建作图群体。3．3茎尖培养及加倍效果由茎尖培养得到的689组培苗有：689．1，689—4，689．5，689—7，689．9，689．10，689-11，689—12，689．15，689．18，689—19，689．20，689．22，689．23．组培苗在培养基中的加倍效果很差，经流式细胞仪检测未发现有加倍成功的植株。3．4木质素含量测定结果木质素含量测定结果如表4所示，由表中数据可知，荠菜叶片、叶柄的木质素含量最高，689叶片木质素含量比对照中油821高15％左右，而叶柄却比中油821低。19 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文表4木质素含量测定结果Table4Resultsofthedeterminationofthelignincontent3．5茎秆横切面解剖结构间苯三酚一盐酸染液能将木质素染成红色，观察发现结荚期时689和中油821中茎秆横切面解剖结构有明显差异，表现为木质素在689茎秆中维管系统的横向分布范围更广(图3箭头所示)，初花期时两材料的茎秆横切面解剖结构也有明显差异，689茎秆中染色更深说明其茎秆内木质素含量更多，这种差异在靠近植株顶端的部位更明显(图4箭头所示)，同时发现同一植株由根部到顶部的茎秆中木质素含量越来越少。 甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究图3：689和中油821结荚期的茎秆横切解剖结构。A：689；B：中油821；箭头所示维管束区域。Fig3：Theanatomicalstructureofthetransversesectionof689andzhongyou821inthePoddingperiod．A：689；B：zhongyou821；arrowheadsforthevascularbundlearea．囚回3图4：689和中油821初花期的茎秆横切解剖结构。A：689；B：中油821；①②③④⑤分别为植株从根部到头部的五个部位，箭头所示木质素的分布位置。Fig·4：Theanatomicalstructureofthetransversesectionof689andzhongyou821atthebeginningofflowering．A：689；B：zhongyou821；①②③④⑤respectivelyfortheexcisedpositionofthestemfromroottothetop，arrowheadsfordistributionareaoflignin．21 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文3．6石蜡切片与徒手切片一样，间苯三酚一盐酸染液将木质素染成红色，且观察到木质素主要存在于植物的维管壁中。子叶期时，木质素在689下胚轴的横切面中分布区域比中油821广(图5，AB箭头所示)，且两材料中维管束的大小和排列有明显差异(图5，CD箭头所示)，689中维管束的直径大、排列较松散；而中油821中维管束的直径小、排列紧密。而在根中却得到相反的结论，木质素在中油821中的分布区域比689广且染色也更深(图6箭头所示)。 甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究图5：木质素在689和中油821子叶期的下胚轴横切面的分布。689：AC；中油821：BD，箭头所示为维管束。放大倍数：AB，10xlCD，40x。Fig．5：Thedistributionofiignininthetransversesectionofthehypoeotylof689andzhongyou821inthecotyledonstage．689：AC；zhongyou821：BD，arrowheadsforthevascularbundles．Magnification：AB，10x；CD，40x．23 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文图6：木质素在689和中油821子叶期的根部横切面的分布。A：6891B：中油821，箭头所示为维管束。放大倍数：20x。Fig．6：Thedistributionoflignininthetransversesectionoftherootof689andzhongyou821inthecotyledonstage．A：689；B：zhongyou821．arrowheadsforthevascularbundles．Magnification：20x．苗期时，通过石蜡切片发现，689茎秆横切面中木质素所在区域(维管组织)比中油821厚(图7，CD箭头所示)，而中油821茎秆中皮层组织却比689厚(图7，AB箭头所示)，同时发现作为689亲本之一的荠菜茎秆中木质素的含量非常丰富，在维管壁和维管束间纤维组织中都有分布(图7，E箭头所示)。在叶片、叶柄中也观察到木质素在689中的分布更多(图8、图9箭头所示)。24 甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究图7：木质素在689、中油821和荠菜苗期的茎秆横切面的分布。689：AC；中油821：BD；荠菜：E，AB箭头所示皮层组织，CDE箭头所示维管组织。放大倍数：AB，4x；CD，20x：E，40x。Fig·7．ThedistributionofHguininthetransversesectionofthestemof689，zhongyou821andCapsellabursa-pastorisintheseedlingstage．689：AC；zhongyou82l：BD；Capsellabursa-pastoris：E，arrowheadsinABforthecortex，arrowheadsinCDEforthevasclIlarbundles．Magnification：AB，4x；CD，20x；E，40x．2S 图8：木质素在689和中油821苗期的叶片横切面的分布。A：689；B：中油821，箭头所示木质素分布位置。放大倍数：40x。Fig·8：Themstributi。n。fiignininthetransversesection。ftheleaf。f689andzh。ngyou821inthe8eedIingstage·A：689；B：zhongy。u821，arrowheadsforthedistributi叫area。flignin．Magnification：40x．图9：木质素在689和中油821苗期的叶柄横切面的分布。C：689；D：中油821，箭头所示木质素分布位置。放大倍数：40x。Fig·9：Thedistribution。flignininthetransversesection。fthepeti。leof689andzhongyou821intheseedⅡngstage·c：689；D：zhongy。u821，arrowheadsforthedistributiona阳a。flig山．Magnification：40x．26 甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究盛花期时，木质素在689花柄、花萼中的分布比中油821多(图10、图11箭头所示)，且中油821的花瓣中几乎观察不到木质素的存在而在689中却可以观察到(图12箭头所示)。在子房的横切面中观察到689的某些位置有木质素存在而中油821中相应位置却没有(图13，AB三角形所示)，或者是在689的某些位置木质素分布更多(图13，CD箭头所示)；木质素在689和中油821的花药横切面的分布差异是非常显著的，在689的花药壁中观察到有木质素的分布而中油821中却没有(图14箭头所示)。图10：木质素在689和中油821盛花期的花柄横切面的分布。A：689；B：中油821，箭头所示木质素分布位置。放大倍数：20x。Fig．10：Thedistributionoflignininthetransversesectionoftheflowerstalkof689andzhongyou821intheflorescencestage．A：689；B：zhongyou821．arrowheadsforthedistributionareaoflignin．Magnification：20x． 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文图1l：木质素在689和中油821盛花期的花萼横切面的分布。A：689；B：中油821，箭头所示木质素分布位置。放大倍数：40x。Fig．11：ThedistributionofHgnininthetransversesectionofthecalyxof689andzhongyou821intheflorescencestage．A：689；B：zhongyou821．arrowheadsforthedistributionareaoflignin．Magnification：40x．图12：木质素在689和中油821盛花期的花瓣横切面的分布。c：689：D：中油821，箭头所示木质素分布位置。放大倍数：40x。Fig．12：Thedistributionoflignininthetransversesectionofthepetalof689andzhongyou821intheflorescencestage．C：689；D：zhongyou821．arrowheadsforthedistributionareaoflignin．Magnification：40x．28B 图13：木质素在689和中油821盛花期的子房横切面的分布。689：AC；中油821：BD，箭头和三角形所示木质素分布的位置。放大倍数：AB，20x；CD，40x。Fig．13：Thedistributionoflignininthetransversesectionoftheovaryof689andzhongyou821intheflorescencestage．689：AC；zhongyou821：BD，arrowheadsandthetriangleforthedistributionareaofllgnin．Magnification：AB：20x；CD：40x．29 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文图14：木质素在689和中油821盛花期的花药横切面的分布。689：AC；中油821：BD，箭头所示木质素在花药壁中的分布。放大倍数：AB，20x；CD，40X。Fig．14：Thedistributionoflignininthetransversesectionoftheantherof689andzhongyou821intheflorescencestage．689：AC；zhongyou821：BD，arrowheadsforthedistributionofHgninintheantherwall．Magnification：AB：20x；CD：40x．30 甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究结荚期时，木质素在689和中油821中果柄横切面的分布差异与苗期时茎秆中的差异是一致的，即689果柄横切面中木质素所在区域(维管组织)比中油821厚(图15，AB箭头所示)，而中油821果柄中皮层组织却比689厚(图15，AB三角形所示)，同时发现荠菜的果柄中皮层和维管组织都较厚(图15，C三角形和箭头所示)。在689和中油821的种皮横切面中发现间苯三酚一盐酸染液将其染成一种红棕色，可能是由于种皮本身是棕色的缘故。观察其结构发现，689种皮中染色略浅且组织排列较疏松，而中油821中染色较深且组织排列紧密(图16)。由于盛花期的茎秆和结荚期的角果及种子组织太硬，用15％HF酸软化后，效果也不是很好，在切片的时候不能形成蜡带且切下来的组织切片经染色观察后发现组织都被切坏而不完整。A里图15：木质素在689、中油821和荠菜结荚期的果柄横切面的分布。A：689；B：中油821；C：荠菜，三角形所示为皮层组织，箭头所示为维管组织。放大倍数：AB，20x：C，40x。Fig．15：Thedistributionoflignininthetransversesectionofthecarpopodiumin689，zhongyou821andCapsellabursa-pastorisinthepoddingperiod．A：689；B：zhongyou821；C：CapseUabursa-pastoris，thetriangleforthecortex，arrowheadsforvascularbundles．Magnification：AB：20x；C：40x．31 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文图16：689和中油821结荚期的种皮横切解剖结构。A：6891B：中油821。放大倍数：20x。Fig．16：Theanatomicalstructureofthetransversesectionoftheseedcoatin689andzhongyou821inthepoddingperiod．A：689；B：zhongyou821；Magnification：20x．32 甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究4．讨论4．1杆硬材料689加倍效果不理想的原因分析通过小孢子培养得到的689单倍体幼苗浸根加倍效果不理想，分析原因可能是689植株中木质素含量高而阻止秋水仙素进入组织内从而影响染色体加倍。因为秋水仙素作为一种有毒物质对于植物来说是一种非生物胁迫，而木质素作为植物中的结构性物质可以阻止它的渗入。曾经有科学家研究木质素在植物抗菌核病中的作用时，提出木质素通过增强细胞壁的硬度来限制毒素从病原体到宿主以及营养物质从宿主到病原体的扩散，同时限制了外源酶对宿主细胞壁的降解(Ride1978)，此研究结果便很好的支持了上述原因的可能性，所以对于木质素含量高的材料，染色体加倍可以尝试在培养基中进行，此时的组培苗幼嫩，木质素含量相对较低或者浸根加倍的时候可以适当延长加倍时间。4．2木质素含量测定及染色方法的不足木质素含量测定结果表明荠菜中的木质素含量很高，这与其抗菌核病(Chenetal2007)是有相关性的。作为其杂种后代的689茎秆中木质素含量高也是有据可依的，而由于植物抗菌核病不仅与木质素含量有关还与木质素的组成有关(如S／G比例)(Gayosoetal2010)，因此在今后的研究中可以采用Thioacidolysis(硫酸解法)和气相色谱质谱仪联合的方法测定植物中不同木质素类型及含量(Chenetal2012)。酸性问苯三酚可以将木质素中的4．O．羟基化肉桂醛结构(松柏醛和芥子醛通过4．O键相连接)染成红．粉色，这种物质是最先定位至次级木质部细胞壁上的(Pomaretal2002)。因此，酸性间苯三酚只能对G型木质素和S型木质素的聚合物进行染色而不能将其分开。Eynck等(2012)在亚麻荠中利用Miiulereagent(高锰酸钾一浓氨水)的染色方法将G型木质素和S型木质素分离开。本实验在制作石蜡切片过程中，曾经借用过此种方法，但是染色效果并不理想，并不能很好的将两种类型的木质素区分开，推断其原因是可能与材料及切片制作方法不同有关。 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文4．3木质素在植物组织中的分布及其作用子叶期时通过石蜡切片观察发现，木质素在689下胚轴的横切面中分布区域比中油821广，且689中维管束的直径大、排列较松散；而中油821中维管束的直径小、排列紧密。苗期时，689茎秆横切面中木质素所在区域(维管组织)比中油821厚，而中油821茎秆中皮层组织比689厚。由此推测，木质素在茎秆中的这种分布差异与689对菌核病的抗性是高度相关的。关于油菜茎秆解剖结构与其对菌核病抗性的相关研究目前还很少，但是曾经有研究者用番红．固绿的双重染色方法研究了甘蓝型油菜茎秆横切面解剖结构的差异与其抗倒伏性状的相关性研究，结果表明维管束区域占茎秆横切面的比值越大，维管束排列越紧密，甘蓝型油菜的抗倒伏性越好(姜维梅等2001；李尧臣等2011)。从本研究的切片结果中可以看出抗病材料689茎秆中木质素所在区域占茎秆横切面的比值比对照大，由此可以设想抗病材料689的抗倒伏性比对照中油821好，在今后的实验中可以进行验证。关于689中维管束的排列比对照的松散，可能是由于染料不同造成的，因为本实验所用的酸性间苯三酚染料只能对木质素进行染色而对于其他的角质化组织、纤维素壁及细胞质都不能进行染色。而在根中却得到相反的结论，木质素在中油821中的分布区域比689广且染色也更深，这与两种材料其他组织中木质素的分布差异是相反的，分析原因可能与木质素合成的空间控制有关，木质素合成代谢途径中相关基因在不同组织中的表达量都不一样，但是关于木质化的空间控制的分子机理目前研究的还很少，Zhong等(2000)筛选出两株拟南芥e勿J突变体，在其茎秆中发现木质素的分布出现异常，在野生型植株中，木质素仅在木质部和维管束间纤维组织中分布，而在突变体中，木质素除了在木质部和维管束问纤维组织中分布外，在髓中的薄壁细胞中也有异常的聚积，同时发现木质素代谢途径中的咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶(CCoAOMT)在突变体的髓细胞中有异常表达。因此作者推出：在正常植株中，ELPl基因抑制髓中木质素的合成。研究表明，核盘菌在田间侵染和子囊孢子萌发的主要媒介是油菜花瓣(赵丹丹等2010)，我们在田间对689进行剥蕾杂交时，发现其花瓣相对于其他材料更有韧性，由石蜡切片的结果可以看出木质素在689花萼和花瓣中的分布都较对照多，这34 甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究与该材料抗菌核病是有一定相关性的。本实验观察到酸性间苯三酚并没有将种皮染成很明显的红色，说明种皮中的G型和S型木质素含量很少，至于种皮中含有哪种类型的木质素，目前研究的还很少。Chen等(2013)在香草和仙人掌的种皮中发现有一种稀有木质素(C型木质素)，很多研究者曾经在转基因植物中发现过这种木质素，它的形成是因为木质素合成途径中的CCoAOMT酶的甲基化作用被阻断所致(Maritaetal1999；Ralphetal2001；Wagneretal2011)。 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华中农业大学2013届硕士研究生学位论文附录附表1小孢子培养所需培养基母液配方(单位为g，1)SupplementalTable1Motherliquidforthemediumofmicrosporeculture(unitg／1)B5MSNLN大量元素(20x)KN03NH4N03CaCl2‘2I-120MgS04‘7H20KH2P04(NH4)2804NaH2P04·2H20Ca(N03)2。4H20Fe盐(20X)FeS04。7H20Na2EDTA微量元素(200X)KIH3803MnS04·H20ZnS04‘7H20Na2MoS04‘2H20CuS04-5I-120CoCl2·6H20有机成分(200X)5052．683．3920．5560．7460．15O．620．4O．050．00538338．87．43．4一-0．5560．7460．1661．244．461．720．050．0052．5一-2．5一-100．5560．7460．1661．243．4742．1180．050．005肌醇20烟酸0．20．11甘氨酸一0．40．4烟酸硫胺(B1)20．020．1盐酸吡哆素(B6)0．20．1叶酸一0．1生物素一-0．01谷氨酰胺一160丝氨酸一-20一查些苎丛!垒兰坚：：生．——____-_I-__l_-_I-_l_l__-_--___I_l-__-I_l__-_-ll_-_--●____--——————————————————————————————一一 甘蓝型油菜抗菌核病新材料的抗病机理及遗传研究2、各种培养基配方A)B5．13培养基(1000m1)a)大量(20X)b)Fe盐(100X)c)微量(200X)d)有机(200X)e)蔗糖D肌醇B)NLN一13培养基(1000m1)a)大量(20X)50ml、b)Fe盐(20X)50mlIc)微量(200X)5mlId)有机(200X)5mlle)蔗糖1309>定容至1000mlPH调为5．85三篡黻0瞄．19(Glu)gI曲谷氨酰胺o．89Ih)丝氨酸o．19Ii)谷胱甘肽0．039／C)固体B5．3a)大量(20X)50mi、b)Fe盐(20X)50m1Ic)微量(200X)5mlld)有机(200X)5mlf定容至1000mlPH调为5．88D蔗糖2m3吧ID琼脂79／注意：B5培养基可以高压灭菌，NLNl3不能高压灭菌，用0．22um滤膜抽滤灭菌。47 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文致谢本课题在选题及研究过程中得到了导师李再云教授的亲切关怀和悉心指导。在课题研究策划中，李老师非常耐心的为我指点迷津，帮助我开拓研究思路；在实验遇到瓶颈的时候，李老师则鼓励我不能气馁，要静下心来思考问题所在，同时要多阅读文献，从他人的思路中得到启迪。李老师严谨求实的态度，一丝不苟的作风，踏踏实实的精神，平易近人的人格，不仅让我领悟到了科研的高尚，还教会了我做人的道理，虽然只有三年时光，但是从中学会的将是我人生中的一大笔财富。对李老师的感激之情是无法用言语来表达的，我只有通过具体行动来实现，在以后的工作和学习当中，我将谨记李老师教诲，创造出自己的一片事业。因为我深深的知道，学生的成长成才是对老师最大的感恩和回报。本研究的顺利完成还与葛贤宏副教授的热忱帮助和疑难解答密不可分，在此，向葛老师表达我最衷心的感谢。感谢钱春香师傅对我田间工作的帮助和支持。感谢张雪丽、邵玉娇、马亚克、丁力、周影影、康雷、付文芹、周建男等师兄师姐在我实验过程中给予的帮助。感谢关慧、张大为、冯烨宏、朱斌、谭晨、朱虹、杨易、党艳玮、丁梦思、潘琪、沈钰森、张桂荣、唐彩艳、明小云等同学的合作和支持。感谢室友刘青青、叶莎菲对我生活和精神上的关心和鼓励，不知不觉，我们从本科到研究生阶段已经相处了七年之久，有了你们，让我感觉到了像家一样温暖的寝室生活，虽然不久之后我们将纷纷离开，但是我们的友情将会更加深刻。感谢辛苦将我养大的父母，你们的鼓励和支持是我学习的最大动力，你们的养育之恩，我无以回报，只希望你们永远健康快乐。最后，感谢所有帮助和关心过我的老师、同学和家人，在这里请接受我最诚挚的谢意。