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1、《生物工程进展》1999,Vol.19,No.1丝状真菌基因工程研究进展[1,2]11闫培生 罗信昌 周 启(1华中农业大学应用真菌研究所,武汉 430070)(2莱阳农学院植保系应用真菌研究室,山东莱阳 265200)摘要 本文评述了丝状真菌基因工程的研究进展,内容涉及已被转化成功的90余种丝状真菌种类及其所利用的选择标记,比较了几种外源DNA进入丝状真菌受体的方法,并较为详细地评述了丝状真菌复制型与整合型转化及其转化子的有性生殖与无性生殖的遗传稳定性,最后,展望了丝状真菌基因工程在农业、工业和医药方面的应用。表明了丝状真菌基因工程具
2、有广阔的应用前景。关键词 丝状真菌;基因工程;遗传转化。 丝状真菌在工业、农业、医药以及基础生物化,丝状真菌摄取外源DNA的方法途径,丝状学研究中具有重要作用。例如,重要的抗生素产真菌转化子的遗传稳定性以及丝状真菌基因工生菌—产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)和程的应用等内容。顶头孢霉(Cephalosporiumacremonium)分别能1 转化的丝状真菌种类与选择标记产生青霉素和头孢菌素,用于疾病的治疗,而有些丝状真菌又能产生对人体有害的物质,如黄111 转化丝状真菌种类曲霉毒素产生菌黄曲霉;一些工业丝状真
3、菌(如第一个被转化的丝状真菌是由Mishra和[1]黑曲霉Aspergillusniger和米曲霉A.oryzae)Tatum于1973年报导的粗糙链孢霉,他们用被广泛用于生产酶类(如蛋白酶和淀粉酶)和有来自野生型菌株的总DNA处理肌醇缺陷型菌机酸(如柠檬酸等);丝状真菌又是重要农作物株获得了肌醇原养型转化菌落,但当时尚没有的致病菌,并能导致粮食等贮藏过程中的腐败可利用的分子技术对转化子进行鉴定,Case[2]变质,同时又有一些丝状真菌(如白僵菌、绿僵等于1979年首次证实了DNA介导的粗糙菌、哈氏木霉等)可用于作物病虫害的生物防链孢霉
4、的遗传转化,他们证实在转化子中含有治;丝状真菌中的构巢曲霉(A.nidulans)和粗整合于染色体上的质粒DNA片段,随后,在越糙链孢霉(Neurosporacrassa)由于其相对简单来越多的丝状真菌中实现了遗传转化,据作者性而被作为“模式”种用于真核生物的一些基础不完全统计,截止到1995年已有90余种丝状生物学特性研究。由于丝状真菌在经济上和科真菌转化成功,其中有许多种类可被具有不同学中的重要性,多年来一直被广泛地研究,以便选择标记的多种载体所转化。已转化成功的丝了解和控制其有益和不利性状。状真菌中有工业真菌(如黑曲霉、米曲霉等)
5、、医基因工程首先在原核生物—细菌中获得成用真菌(如产黄青霉、顶头孢霉)、植物病原真菌功,这大大地激励了许多科学家将这一技术应(如玉米黑粉菌、小麦全蚀菌等)、杀虫真菌(如用到丝状真菌的研究中,目前丝状真菌的遗传白僵菌、绿僵菌)、真菌上寄生真菌(如哈氏木转化(基因工程)在理论上和应用上均取得了较霉)、食用真菌(如裂褶菌、鬼伞等)、菌根真菌大的进展,本文评述了转化的丝状真菌种类及(如卷边桩菇、漆蜡蘑等)等。选择标记,丝状真菌的复制型转化和整合型转112 选择标记。36R遗传转化通常是稀有事件,因此,从大量的的丝状真菌约有12种,寡霉素抗性(o
6、li)作为未转化细胞(原生质体)背景中筛选转化子必须一种半显性抗性具有种的特性,因而其应用受依赖于可供选择转化子的遗传标记,筛选所希到限制。用于丝状真菌转化的报导基因有E.[4]望的转化子通常是将经DNA处理的样品涂布coliB——半乳糖苷酶基因(lacZ)、E.coliB2[5]于琼脂平板培养基上而进行,筛选策略可基于葡糖苷酶基因(GUS)。利用报导基因可通过原养型生长、药物抗性、抗生素抗性或利用报导与指示化合物的显色反应而视觉检测导入的基基因通过视觉而筛选。因所编码的酶活性,并可对其表达水平定量化,最初转化的丝状真菌多是利用营养缺陷
7、型同时,还可利用融合有报导基因的载体获取启菌株而进行的,通过将野生型等位基因转移到动子序列,并比较其启动子效率高底。相应的营养缺陷型菌株中,在基本培养基中筛2 外源DNA导入丝状真菌受体的方法选原养型生长菌落而得到转化子,目前,已用于丝状真菌转化的野生型标记基因有ade(腺嘌外源DNA导入丝状真菌中最普遍使用的[6]呤)(据统计有2种丝状真菌被转化,下同)、方案是CaCl2öPEG介导的原生质体转化。首met(蛋氨酸,3种)、pyr(嘧啶,17种)、trp(色氨先是用溶壁酶处理菌丝体或萌发的孢子获得原酸,9种)、nic(尼克酸,1种)、
8、ribo(核黄素,1生质体,然后将原生质体、外源载体DNA混合种)、arg(精氨酸,7种)、len(亮氨酸,3种)、pro于一定浓度的CaCl2、PEG(聚乙二醇)缓冲液(脯氨酸,1种)、inl(肌醇,1种
