prrsv+gp2和m蛋白免疫活性及其在感染细胞内分布初步的研究

《prrsv+gp2和m蛋白免疫活性及其在感染细胞内分布初步的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、河南农业大学2009届预防兽医学硕士学位论文捅要猪繁殖与呼吸综合征(PorcineReproductiveandRespirationSyndrome，PRRS)是以妊娠母猪繁殖障碍及各年龄阶段猪呼吸道症状为主要特征的传染病。其病原猪繁殖与呼吸综合征病毒(PorcineReproductiveandRespirationSyndrome，PRRSV)基因组中一共有6种结构蛋白基因，分别由ORF2、ORF3、ORP4、ORP5、ORF6和ORF7基因编码病毒的GP2、GP3、GP4、GP5、M蛋白和N

2、蛋白，其中M蛋白是主要结构蛋白，具有很强的免疫原性，用体外表达的重组M蛋白可以作为血清学试验的靶抗原，但是，该蛋白的结构和功能还不是很清楚；GP2蛋白是次要结构蛋白，目前关于GP2蛋白功能研究的报道仍然很少。所以本实验对PRRSVnn一I／06株的GP2和M蛋白进行了初步研究。本研究利用RT-PCR从PRRSV河南分离株Hn-I／06克隆得到了大小约525bp片段的ORF6基因和771bp片段的ORF2基因，并将扩增的基因片段克隆到pTGl9-T载体中进行测序。利用DNAStar软件进行序列分析，结

3、果表明河南分离株Hn-I／06属于美洲型，同时将Hn一I／06株ORF6和ORF2基因的核苷酸序列和推导氨基酸序列与ATCCVR2332、LV、Resp、CH-Ia、BJ-4、S1、CC-I、HB-1、Jx0612、HUBl等分离株进行了同源性分析，Hn-I／06株与空间距离较近的JX0612、HUBl同源性极高，核苷酸同源性能达到99％以上，推导氨基酸同源性达98％以上；而与空间距离较远的Resp、CC-I同源性次之。这在一定程度上说明了PRRSV的同源性与空间距离密切相关，空间距离越近同源性越高

4、；反之，空间距离越远同源性越小。根据PRRSV河南分离株Hn-I／06株ORF6和ORF2基因设计表达引物，扩增出两端带有历蒯I／HindIII酶切位点的ORF6基因和BaaBI／XhoI酶切位点的ORF2基因，将其亚克隆到原核表达载体pET32a和pGEX一6p一1中构建了重组表达质粒pET32a—dORF6和pGEX—dORF2，在IPTG的诱导下成功表达，获得了大小分别约为29KD、44KD的融合蛋白rdM和rdGP2，与预期结果相符；通过对表达条件进一步优化，获得了融合蛋白的高效表达。应用纯

5、化的融合蛋白经SDS—PAGE电泳和Westernblot鉴定，目的蛋白纯度高达90％，并具有良好的免疫学活性。用GP2和M融合蛋白免疫小鼠，获得了鼠抗重组GP2和M蛋白抗体。通过本实验室建立的间接ELISA及IFA方法对鼠抗重组GP2和M蛋白抗体的免疫活性进行检测，结果显示鼠抗GP2和M重组蛋白抗体的效价分别为l：10和l：20，且没有中和活性。用本人建立的IFA方法对GP2和M蛋白在PRRSV感染的Marc-145细胞内的分布进行了检测，结果显示，在PRRSV感染24h即可检测到M蛋白，且可随时

6、间的增加有所增加，但未检测到GP2蛋白。鼠源抗体的制备及IFA方法的建立，为GP2和M蛋白的生物学和免疫学功能方面的研究打下了坚实的基础。关键词：PRRS；河南分离株Hn一I／06株；GP2蛋白；M蛋白；原核表达：ELISA河南农业大学2009届预防兽医学硕士学位论文IMMUNOCoMPETENCEANDDISTRIBUTIONoFGP2ANDMINTHEINFECTEDCELLSBYPRRSVSupervisor：Prof．XiaPing’anMasterCandidate：LiuMingliAB

7、STRACT：PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome(PorcineReproductiveandRespirationSyndrome，PRRS)isapregnantSOWreproductivestageandageofpigforthemainfeaturesofrespiratorysymptomsofinfectiousdiseases．Itspathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndrome

8、virus(PorcineReproductiveandRespirationSyndrome，PRRSV)genomesinatotalofsixkindsofstructuralproteingenes，respectively,fromtheORF2，ORF3，ORF4，ORF5，ORF6andORF7genesencodingvirusGP2，GP3，GP4，GP5，MproteinandNprotein，Mprotein，whichisamajorstruc