基于dna链置换反应的新型荧光传感器的构建及生化分析应用研究

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1、学校代号10530学号201510141337分类号O657.3密级公开硕士学位论文基于DNA链置换反应的新型荧光传感器的构建及生化分析应用研究学位申请人胡盼指导老师杨斌讲师学院名称化学学院学科专业化学研究方向分析化学二零一八年六月十号ConstructionandApplicationofaNovelAptamerFluorescentProbeBasedonDNAStrandDisplacementReactionCandidatePanHuSupervisorLecturerYangBinCollegeCollegeofChe

2、mistryProgramChemistrySpecializationAnalyticalChenistryDegreeMasterofScienceUniversityXiangtanUniversityDateJune10,2018湘潭大学硕士学位论文I湘潭大学硕士学位论文摘要随着基因诊断、疾病研究、环境污染、食品安全监测等领域的发展，研究者们构建了多类荧光生物传感器。其中，基于支点介导链置换反应所构建的荧光生物传感器具有无酶、操作简单、响应迅速等优点，被广泛应用于各类目标物的分析检测中。然而，该策略在支点的活化控制方面仍存在

3、挑战，其支点区域存在序列依赖性，使之无法设计出通用型荧光生物传感器也是弊端之一。另外，荧光各向异性(FA，Fluorescenceanisotropy)分析检测方法由于其仅需要单标记，可克服光漂白、可在复杂样品中使用等特点，得到了广泛应用。基于荧光各向异性所构建的荧光生物传感器大多需要对二级结构进行特殊设计或使用纳米材料，存在设计复杂、无法兼容酶放大策略等问题。本文针对现存问题进行研究，内容如下：(1)基于协同支点激活链置换反应机制所构建的生物传感器：我们构建了“协同支点”，用以激活支点介导链置换反应。协同支点是两段完全独立的DNA

4、片段，通过相邻碱基之间的堆积作用，激活支点进行链置换反应。我们通过实时荧光检测以及非变性凝胶电泳实验，验证了该原理的可行性，对DNA的检测下限为0.5nM，线性范围为1-10nM，R2=0.9979。通过远程支点以及可逆性实验，证实该体系与其它策略具有相容性，可在复杂体系中进行应用。(2)通用型DNA荧光传感器的构建及其在生物分析中的应用：基于传统支点介导链置换所构建的荧光生物传感器具有序列依赖性，使其无法设计通用型荧光传感器。根据我们所提出的“协同支点”激活机制，我们构建了一种通用型荧光生物传感器用于miRNA、ATP的分析检测以

5、及对PCR扩增体系进行监测。miRNA检测限度为2nM，线性范围为0-20nM，R2=0.990。ATP检测限度为5μM，线性范围为0-50μM。而PCR扩增在pUC18浓度为400aM-400pM范围下，与荧光信号对数呈现出线性关系，可用于分析检测aM水平的pUC18质粒。(3)基于DNA-蛋白质复合分子信标的高效荧光各向异性生物分析信号转换器：我们以DNAzyme-Pb2+为代表，提供了一种基于可切断的DNA-蛋白质分子信标。构建一种用于荧光各向异性生物分析的信号转化策略。DNA-蛋白质复合分子信标同时具有分子信标分子内稳定性以

6、及链酶亲和素大分子量的优点，可有效放大荧光各向异性。关键词：荧光生物传感器；支点介导链置换；荧光各向异性；复合分子信标II湘潭大学硕士学位论文AbstractWiththedevelopmentofgeneticdiagnosis,diseaseresearch,environmentalpollution,andfoodsafetymonitoring,researchershaveconstructedavarietyoffluorescentbio-sensingstrategies.Amongthem,fluorescenc

7、ebiosensorsbasedonthetoehold-mediatedstranddisplacementreaction(TSDR)havebeenwidelyusedintheanalysisanddetectionofvarioustargetsbecauseoftheiradvantagessuchasnoenzyme,simpleoperationandrapidresponse.However,thisstrategystillhaschallengesintheactivationofthetoehold,andi

8、tssequence-dependencymakesitimpossibletodesignauniversalfluorescentbiosensor.Inaddition,thefluorescenceanisotropy(FA)