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《中国家蚕抗菌肽人工合成类 cm ⅳ基因在 甜菜夜蛾new》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、41卷6期微生物学报Vol.41No.62001年12月ActaMicrobiologicaSinicaDecember2001中国家蚕抗菌肽人工合成类CMⅣ基因在3甜菜夜蛾虫体中的表达1112赵东红戴祝英周开亚张林元(1南京师范大学生命科学院南京210097)(2南京军区军事医学研究所南京210012)摘要:将人工合成的中国家蚕抗菌肽类CMⅣ基因与抗菌肽信号肽基因连接,经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切后,克隆于pFASTBacⅠ的EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点之间,得到重组转座载体pFASTBac2ABP,经测序证明阳性克隆正确。将重组转
2、座载体转化HD10Bac大肠杆菌,得到重组Bacmid2ABP。将重组Bacmid转染sf21细胞及感染甜菜夜蛾(Laphygmaexigua)幼虫,在培养细胞上清及虫体血淋巴中均测到抗菌活性。经Northernblotting证明感染甜菜夜蛾幼虫中有类CMⅣmRNA的存在。且表达产物在酸性电泳中电泳行为与天然抗菌肽CMⅣ组分相似。为进一步利用昆虫细胞及虫体生产抗菌肽药物打下了基础。关键词:中国家蚕抗菌肽类CMⅣ基因,昆虫杆状病毒表达系统,Bac2to2Bac策略,sf21细胞,甜菜夜蛾幼虫中图分类号:Q933文献标识码:A文章编号:00
3、0126209(2001)0620680206[1,2]昆虫抗菌肽(antibacterialpeptide,ABP)是昆虫免疫后产生的一类抗菌多肽。抗菌[3]肽CMⅣ是中国科学家首次从家蚕中分离纯化并测定一级序列的,它由35个氨基酸残[4,5]基组成,无免疫原性,对热和酸碱稳定,具有广谱抗菌及抗癌活性,有望成为新型的抗菌抗癌药物。[6]为了更好地研究抗菌肽的作用机理以及提高其抗菌抗癌活力,李秀兰等根据天然抗菌肽CMⅣ的基因结构,在计算机的帮助下,对其基因进行了近60%的改造,设计并合成了一种新型的抗菌肽基因一类CMⅣ基因。为了模拟天然抗
4、菌肽,在其终止密码子前设计了一个天冬酰氨密码子AAC,以便直接翻译出C2末端带酰胺的多肽。我们虽然已成[6]功地在大肠杆菌中表达了类抗菌肽基因并得到活性,但是大肠杆菌表达系统还存在内毒素污染等问题,因而影响了表达产物的临床应用。为了更好地研究该抗菌肽的特性,需要构建一个高效表达的体系,以制备大量抗菌[7]肽。BactoBac杆状病毒表达系统是目前最好的杆状病毒克隆表达策略,该系统不需空斑纯化,因此大大减少了鉴定和纯化重组病毒的时间。本文采用新型的BactoBac杆状病毒表达系统表达了该抗菌肽基因,在sf21细胞及甜菜夜蛾(Laphygma
5、exigua)幼虫虫体中得到了抗菌活性。为进一步利用昆虫细胞及虫体生产抗菌肽药物打下了基础。3国家自然科学基金资助项目(39670116)作者简介:赵东红,讲师,在职博士生,从事分子细胞生物学方面的研究,联系人。Tel:025-3598500;e2mail:zhaod2hong@21cn.com收稿日期:2000211229,修回日期:20012022036期赵东红等:中国家蚕抗菌肽人工合成类CMⅣ基因在甜菜夜蛾虫体中的表达6811材料和方法111材料11111质粒、病毒和细胞:AcNPV的Bac2to2Bac系统:转座质粒pFastBa
6、c1、大肠杆菌DH10Bac、穿梭载体Bacmid购自GibcoBRL公司,大肠杆菌DH5α为本室保存。草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞sf21由美国南加州大学医学院惠赠,细胞在含有10%胎牛血清的TNM2FH培养基中27℃培养。甜菜夜蛾幼虫从南京农业专科学校购买。AcNPV野生病毒由南京大学秦俊川教授赠送。11112试剂:限制性内切酶、T4DNA连接酶、IPTG、X2gal均购自大连宝生生物制品公司,Cellfectin购自GIBCOBRL公司。RNA购自Promega公司。其他试剂均为分析纯产品。112方法1
7、1211质粒的构建及酶切鉴定:参照文献[8]进行。11212重组Bacmid的筛选及转染细胞:将重组pFastBac转化DH10Bac大肠杆菌感受态细-1-2-3胞,37℃复苏4h后,连续10、10、10倍稀释,分别涂布含三抗(50μgPmL卡那霉素、7μgPmL庆大霉素、10μgPmL四环素、100μgPmLX2gal、20μgPmLIPTG)的LB平板。37℃培养24～48h后挑选单个白色菌落,于LB平板上划线以区分表型,37℃过夜后再挑单个白色克隆,液体培养以提取重组BacmidDNA。611213重组Bacmid转染sf21细胞:
8、每10mL细胞瓶接种115×10个sf21细胞,使用TNM2FH培养基于27℃培养,待细胞贴壁后,用Cellfectin与重组Bacmid共转染,72h后待sf21细7胞出现病变,收集含有重组
