鸭疫里默氏杆菌ompa蛋白的免疫原性研究

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1、万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：徐畛2汐／◇年6月IZ日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学

2、位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。口本论文不保密。授权。(请在以上口内划“√”)研究生签名：椽吻导师签名：口本论文保密，在一年解密后适用本20／妒年6月f≥日年月日万方数据四JII农业大学硕士学位论文于两要鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaantipestifer,RA)能引起鸭、鹅、火鸡等多种禽类发生鸭疫里默氏杆菌感染，呈急性或慢性败血性经过。本研究对RAOmpA基因开展了生物信息学分析、克隆表达、蛋白纯化、多克隆抗体制备、基于OmpA蛋白间接ELISA方法的建立、重组蛋白免疫原性等研究，主要结果如下：1RA0mpA基因的生物信息学

3、分析RAOmpA全基因长1208bp，由397个氨基酸编码大小为43．52kDa的蛋白，等电点(pI)为4．81。该蛋白没有信号肽切割位点和跨膜区，有如下功能位点：有4个N．糖基化位点，9个蛋白激酶C磷酸化位点，7个酪蛋白激酶II磷酸化位点，3个N．豆蔻酰化位点。亚细胞定位分析该蛋白主要分布于外膜和细胞之内。氨基酸进化树分析表明该蛋白与黄杆菌科编码OmpA蛋白的其它成员相似性低。该蛋白的抗原性分析表明第185—337位这段氨基酸有连续而且强烈的抗原性。2RA0mpA基因的克隆表达和多抗的制备对RAOmpA基因设计了一对引物，大小为1208bp，构建pJETl．2／OmpA克隆载体及其pE

4、T32a(+)OmpA表达载体，转入表达菌株BL21内进行原核表达，优化的表达条件：在37"C，IPTG终浓度为0．4mmol／L诱导4h的最优条件下重组蛋白能够大量表达。经SDS．PAGE分析蛋白大小约63kDa，并主要以可溶性形式表达于上清，并用切胶的方法纯化该蛋白。纯化的蛋白用兔抗RAATCC菌为一抗，HRP．抗兔为二抗经Wememblot证实，该蛋白具有较好的反应原性。最后，将纯化的蛋白制备兔抗多克隆抗血清，用琼扩的方法测定效价为1：16。3基于OmpA蛋白间接ELISA方法的建立用纯化的重组蛋白作为包被抗原，用鸭抗RAATCC全菌血清作为一抗，HRP．羊抗鸭为二抗进行条件的优化

5、，最后结果为，当包被的浓度为3．612599／mL；一抗最佳稀释度为1：100，最佳反应时间为1．5h；二抗最佳稀释度1：400，最佳反应时间为2h；用I％BSA为封闭液；底物作用时间为30min时的反应条件最佳；并用优化好的条件对26份阴性血清做了阴阳性临界值确定，根据公式，当OD450>0．379时可判为阳性，当OD450≤0．294时可判为阴性；重复性试验结果表明变异系数均小于11％，表明该方法具有较好的重复性；对其它5种常见鸭病的阳性血清均无交叉反应性，说明具有较好的特异性。1万方数据四川农业大学硕士学位论文4重组蛋白免疫原性的研究用纯化的重组蛋白作为免疫原，对雏鸭进行免疫，实验

6、分组：OmpA蛋白组、OmpA蛋白加佐剂组和阴性组。对体液免疫和细胞免疫进行监测，结果表明，所有的结果在二免后都具有显著的升高，而且二免后OmpA蛋白组、OmpA蛋白加佐剂组测得的结果具有较显著的差异。说明仅有OmpA单独作为抗原还是不能引起较强的免疫反应性。关键词：鸭疫里默氏杆菌；OmpA；ELISA；抗体；细胞因子万方数据四川农业大学硕士学位论文AbstractImm‘unogenicityofRiemerellaantipestiferOmpAproteinXUPan(PreventiveVeterinaryMedicine)DirectedbyProfessor：CHENGAnc

7、hunandWANGMingshuRiemerellaanatipestifer(RA)isthecausativeagentofsepticaemicandexudativediseasesinavarietyofbirdspecies．Inthisstudy，whatIdidistheOmpAgene(GenbankaccessionNo．：CP003388．1、fromRADSM15868strain(whichAvianDi