功能化磁性纳米粒子的制备及其联合质谱技术用于金属硫蛋白的富集及鉴定研究

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1、学校代码：10264研究生学号：M150208407上海海洋大学硕士学位论文功能化磁性纳米粒子的制备及其联题目：合质谱技术用于金属硫蛋白的富集及鉴定研究TheEnrichmentandIdentificationofMetallothioneinbyFunctionalized英文题目：Nano-MagneticParticlesandMALDI-TOF/MS专业：食品科学与工程研究方向：蛋白质组学姓名：何新宇指导教师：张炜佳二O一八年四月二日上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导

2、下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学

3、位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日I上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注答辩地点答辩日期II上海海洋大学硕士学位论文功能化磁性纳米粒子的制备及其联合质谱技术用于金属硫蛋白的富集及鉴定研究摘要金属硫蛋白（Metallothionein,MT）是一种具有结合金属能力和高诱导特性的低分子量蛋白质，因此常被视作一种重要的生物标志物用于水环境重金属污染评估。MT的应用十分广泛，在医药，保健食品，抗辐射，化妆品上，都有很好的前景，然而因为自然条件下生物体内金属硫蛋白的含量比较少，传统的金属硫蛋白富集

4、检测主要是先要对动物体利用重金属胁迫诱导，再从动物体的消化腺，肝胰腺等部位提取MT进行研究。传统的提取方法主要是Tris-HCl缓冲溶液或者蔗糖溶液进行匀浆离心，之后再通过高效液相色谱法或者凝胶过滤和离子交换技术相结合的层析法分离纯化。这种方法耗时较长，操作复杂，耗损多，且对蛋白含量要求高。目前检测低丰度蛋白，比较优越的技术是通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）进行分析检测，但是这种检测技术对样品的要求高，盐等小分子会增加噪音，高丰度蛋白经常会压制低丰度蛋白的信号峰，导致检测结果不好，因此，发展低丰度蛋白的富集方法是目前的一个研究热点。磁性复合纳米

5、粒子的发展，为低丰度蛋白的富集提供了新的思路。本论文制备了一种金包覆四氧化三铁的核壳纳米粒子（Fe3O4@AuNPs），Fe3O4@Au核壳纳米粒子具有磁场的快速响应和特殊的光学特性两个主要优点，并且可利用Au-S的强亲和力实现纳米粒子对金属硫蛋白的快速富集，进一步将纯化的蛋白质通过MALDI-TOF/MS进行分析检测。首先，我们进行了Fe3O4@Au核壳纳米粒子的合成及其材料表征研究，首先通过化学共沉淀法合成纳米四氧化三铁，然后对四氧化三铁硅烷化，使其表面修饰上氨基，柠檬酸三钠还原法合成胶体金，通过氨基和Au之间的强吸附力，合成Fe3O4@Au核壳纳米粒子，通过表征我们发现

6、合成的Fe3O4@Au核壳纳米粒子磁响应性较好，但是由于包覆不完全，容易团聚，胶体溶液不稳定。因此，我们通过第二种方法合成Fe3O4@Au核壳纳米粒子，并对其表征，首III上海海洋大学硕士学位论文先合成四氧化三铁纳米材料，然后在表面修饰上柠檬酸根离子，通过柠檬酸根对氯金酸的还原作用，直接在四氧化三铁纳米材料表面修饰上一层金壳，表征可知，合成的Fe3O4@Au核壳纳米粒子不仅磁响应好，粒径均一，且具有良好的分散性，不易团聚，因此，我们将第二次合成的Fe3O4@Au核壳纳米粒子用于后续的MT富集和质谱检测。本研究将BSA与MT的混合物与制备的Fe3O4@Au核壳纳米粒子进行孵育洗

7、涤，通过质谱分析方法鉴定混合物中MT的含量。发现单独的BSA样品在未与核壳粒子孵育即未发生富集情况下，其质谱图中m/z66415.8处出现BSA的最强峰，兔肝MT样品与BSA按照1:1充分混合，混合物的质谱鉴定结果显示在m/z6000~70000的范围内，明显可见BSA的单聚体的最强峰，在m/z6000~7000之间而未发现明显的MT的质谱峰，MT所在峰信号完全被BSA的信号峰压制。然后我们将合成的Fe3O4@Au核壳纳米粒子加入到BSA+MT混合溶液中，孵育５min之后，施加一个外加磁场进行分离，去除