蒙古柳(salix linearistipularis)耐盐相关基因的挖掘研究

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1、学位论文万方数据学校代码：10225学号：B14155蒙古柳(Salixlinearistipularis)耐盐指导教师姓名：申请学位级别：论文提交日期：授予学位单位：相关基因的挖掘研究南桂仙柳参奎东北林业大学博士学科专业：2014年10月东北林业大学论文答辩日期：授予学位日期：答辩委员会主席：论文评阅人：聋岁厶栉素大学生物化学与分子生物学2014年12月万方数据UniversityCode：10225RegisterCode：B14155DissertationfortheDegreeofDoctorResearchofMiningsalttolerancegenesinSal／xli

2、nearistipularisCandidate：Supervisor：AssociateSupervisor：AcademicDegreeAppliedfor：Speciality：Dateof0ralExamination：University：NanGuixianLiuShenkuiDoctorBiochemistryandmolecularbiology2014．12．12NortheastForestry万方数据摘要松嫩平原盐碱土壤的pH值在9．2以上，通过对该地区自然生长的植物资源的调查发现分布着约51科184属的盐生植物，多数以草本植物为主，蒙古柳(Salixlineari

3、stipularis)是松嫩平原盐碱地群落分布的唯一的木本植物，具有较强的耐盐碱性，是松嫩平原盐碱地重要的植物资源。本文以蒙古柳为实验材料分析了盐胁迫条件下蒙古柳响应逆境的生理特性。利用FOXhuntingsystem技术将蒙古柳cDNA文库转入酵母菌和拟南芥，以高NaCl胁迫筛选抗性酵母克隆，建立拟南芥转基因独立株系。另外以NaCl作为胁迫因素对处理和未处理的两组蒙古柳植株进行RNA．Seq分析，并对蒙古柳的转录组与拟南芥转录组进行了比较研究。本研究的主要结果如下：1．蒙古柳资源：在各种非生物胁迫条件下(NaCl、Sorbitol、NaHC03、H202和pH值)对蒙古柳进行了种子萌发

4、和根长的分析，结果表明蒙古柳能够在较高水平胁迫条件下生长，体内的脯氨酸和可溶性糖含量在胁迫条件下有增加的趋势，蒙古柳是一个抗逆性较强的盐碱地木本植物。2．酵母水平筛选：通过对酵母文库的筛选获得抗盐克隆15个，序列分析表明大部分和毛果杨基因有高的相似性，其中包括金属硫蛋白(MT2)、酪蛋白激酶II(CKII)、质膜内在蛋白(PIP)基因，已有研究表明这些基因和盐胁迫相关。3．转基因拟南芥独立株系的建立：将蒙古柳cDNA农杆菌文库转入拟南芥，建立转基因拟南芥独立株系9000多个。转基因拟南芥植株中，鉴定产生生物学性状变化(主要分为叶片大小、株高、分枝数量、植株倒伏、抽薹时期，果荚长、叶片数和

5、叶形态变化)的株系28个。用加入130mMNaCl的1／2MS培养基经初步筛选获得耐盐株系58个。通过测序和序列比对，一个与毛果杨COP9复合体家族蛋白同源性比较高，一个与小麦的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶SAPK7有高的同源性，这些基因和高渗、盐、氧化等非生物胁迫有关。4．SLMT2功能验证：对在酵母文库中筛选的蒙古柳金属硫蛋白(S1MT2)基因的转基因植株(6个株系)解析结果表明，S1MT2转基因拟南芥在NaCl、NaHC03、H202、CuCl2、ZnCl2、CdCl2和Sorbitol等胁迫培养基中表现出比对照强的抗性，其中在CdCl2培养基中比野生型植株表现出强的抗性。5．蒙古柳转录组

6、分析：在盐胁迫下通过转录组研究发现包括1397个上调和1637个下调基因。通过功能富集分析发现2199个基因在50个GO术语和1103个基因在116个KEGG通路中显著富集。本研究把蒙古柳基因按照差异程度分成三类：差异表达量在4倍以上和1．5-4倍，将这两个定义为有差异表达基因；差异表达量在0～1．5倍的基因，定义为没有差异表达基因，把3个集合的基因富集到的通路分别与拟南芥耐盐相关的差万方数据摘要异表达基因注释到的通路进行整合，其中拟南芥盐胁迫差异表达基因富集的通路分别与蒙古柳差异表达量在>4倍的基因富集的通路有1个交集，在1．5—4倍的通路的交集有10个(这样差异表达量≥1．5倍的基因

7、和拟南芥差异表达基因富集的通路交集一共有11个)，0-1．5倍(没有变化)富集的通路的交集有22个。通过与拟南芥有差异表达的基因注释的通路与蒙古柳中没有差异表达基因注释的通路进行比较，我们推断盐胁迫强加给蒙古柳部分基因扮演了组成型的角色，因此本研究通过转录组分析检测出的蒙古柳转录水平变化很可能是在盐碱、干旱条件下长期驯化的结果。根据RT-PCR验证结果显示和RNA-Seq结果基本吻合。关键词蒙古柳，酵母，拟南芥，盐胁迫，FOXhun