转录因子foxa2生物素标记体系构建及其互作蛋白鉴定

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1、万方数据学校代号：10532学号：S132210003密级：湖南大学硕士学位论文转录因子FOⅪ墟生物素标记体系构建及其互作蛋白鉴定学位申请人姓名：奎逾导师姓名及职称：谭捆至教援培养单位：生物堂院专业名．称：生物堂论文提交日期：2Q!互生5且论文答辩日期：2Q!鱼生鱼目答辩委员会主席：割选明塾援万方数据EstablishmentofTranscriptionfactorsFOXA2biotin11aggingsystemandidentificationofinteractionsproteinbyLi．YuB．E．(QinghaiUniVersity)2013Athe

2、sissubmittedinpartialsatisfactionoftheRequrimentsfbrthedegreeofMasterofScienceBiologicalSciencesintheGraduateSchoolofHun孤UniversitySupervisorProfessorTANYbn蓟unApril，2016万方数据湖南大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体

3、，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：《么月夕日用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1．保密口，在年解密后适用本授权书。2．不保密匣(请在以上相应方框内打”√”)作者签名：导师签名：日期：>9历年么月夕日日期：，≯，芬年石月‘墨矛兰，y司毒豺{驾万方数据硕士学位论文摘要乳腺癌是发

4、生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。乳腺癌作为威胁女性健康最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率在中国上升趋势明显。乳腺癌细胞的生长特性是：能无限生长、具有转化和转移能力。因此通过对乳腺癌发生、发展作用机制进行深入研究，以期为肿瘤治疗方案及临床耐药提供新的靶点。生物素Avi—tag技术是指在目的蛋白的N端或C端加上由15个氨基酸(GLNDIFEAQKIEWHE)组成的受体肽小标签，该小标签可被生物素连接酶BirA特异性识别，并且生物素连接酶可催化生物素转移到靶标蛋白标签上的赖氨酸残基上，导致带有标签的靶标蛋白在体内能被生物素化。该生物素化过程为酶促反应，反应条件温和，标记特异性强

5、、专一性高，同时由于序列短小，仅仅只有l5个氨基酸，对靶标蛋白的构象及活性影响极低。链霉亲和素可以特异性地与生物素结合，结合力强。因此，可在严格的洗脱条件下分离出目标蛋白及与其蛋白特异性相互作用的复合体。叉头框(Forkheadbox)家族蛋白被发现大量的存在于真菌及动物体内，这个家族的主要特征是作为转录因子作用于DNA结合序列，于其DNA结合区域序列的极端保守性，并且在这类家族蛋白的尾部具有特殊的翼状螺旋结构。FOXA2是Forkheadbox转录因子家族的成员之一，FOXA2参与胚胎发育，同时抑制多种肿瘤细胞的转移，并在参与细胞干性维持发挥重要作用。临床上发现，在

6、众多肿瘤样品如乳腺癌、肺癌等中发现FOXA2有较高水平的表达，FOXA2高表达或许与细胞的癌变有着密切的关联。此外，FOXA2还参与多种信号通路，包括调控致癌信号多种途径。这些都暗示转录因子FOXA2在肿瘤发生、发展中扮演着重要角色。蛋白互作研究是后基因组时代一个重要研究内容，也是当前非常热门研究领域。生物体内，与外界进行信号交换，都是通过配体与细胞表面的跨膜受体结合，而后通过蛋白．蛋白相互作用层层传递至细胞核中引起特定的生理生化反应。生物机体内每一个小分子都不是独立存在的，而是通过与其它物质结合协同发挥作用，从而形成一个相互交叉紧密联系的网络。控制癌症也不能只抑制单

7、一的信号通路，肿瘤的发生与发展是由多条不同信号通路共同参与、相互影响、相互作用的最终结果。通过以FOXA2为核心、寻找其互作蛋白，分析信号通路调节网络，对于全面认识FOXA2在细胞中的生物学功能，具有十分重要的价值。本课题构建了基于生物素Avi．tag的FOXA2真核表达载体，利用生物素与链霉亲和素的高特异性、高亲和力的结合性质对FOXA2蛋白进行纯化，将所得的II万方数据转录因子FO)【A2生物素标记体系构建及其互作蛋白鉴定蛋白复合体进行考马斯亮蓝染色，质谱分析，然后通过生物信息学进行对比分析，寻找FOXA2可能存在的互作蛋白，然后通过免疫共沉淀等