池蝶蚌亲环蛋白a(cypa)基因特异性表达及多克隆抗体制备

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1、南昌大学硕士学位论文池蝶蚌亲环蛋白A（CyPA)基因特异性表达及多克隆抗体制备姓名：徐灵申请学位级别：硕士专业：水生生物学指导教师：洪一江201106摘要≤嘲麟。池蝶蚌(Hyriopsisschlegelii)原产于日本滋贺县琵琶湖，是日本特有的淡水贝类养殖品种。它隶属于软体动物门、瓣鳃纲、蚌科、与三角帆蚌一样为帆蚌属。与其他淡水珍珠贝类相较，池蝶蚌拥有更好的抗病能力和育珠性能。亲环蛋白(CyclophilinsCyPs)是一种广泛存在于各种生物中的组成型蛋白，具有多种生物学功能。其最重要的两个生物学功能：一是具有肽基脯氨酸顺／反异构酶(pe

2、ptidyl．prolylcis．transisomerases，PPIase)活性能催化蛋白质折叠和转运过程并起着分子伴侣作用；二是具有免疫抑制功能，在体内能介导T细胞进行免疫抑制。CyPA是第一个被发现的CyP家族蛋白【2】。最新研究表明CyPA可能在某些生物中具有免疫应激功能。本研究依据从嗜水气单胞杆菌诱导的池蝶蚌血细胞eDNA文库里获得了池蝶蚌CyPA基因(以下简称HsCypA)cDNA全长，对CypA基因在池蝶蚌中的表达特征和是否存在免疫应激功能进行初步的探索，为研究CyPA基因在淡水贝类中的功能打下基础，为研究无脊椎动物的免疫机制

3、提供一个新的方向。主要研究内容如下：1、利用Real．TimePCR分析了池蝶蚌CyPA基因mRNA在池蝶蚌血液、心、鳃、肠、肝、肾、斧足、性腺等组织及各年龄血淋巴细胞中的表达情况，结果显示HsCyPA基因在各组织中均有表达，其中在肝脏和性腺中表达量最高，在肠和血淋巴中最低；在各年龄中仅在幼龄中的表达量略高于成年蚌，这可能是幼龄蚌血淋巴细胞中的蛋白质合成更加丰富的缘故。2、利用Real．TimePCR技术对嗜水气单胞杆菌诱导刺激后池蝶蚌肝脏、性腺和血液中CyPA基因mRNA的表达量进行了分析，发现在肝脏和性腺中CyPA在诱导4h出现一个表达峰

4、，8h后开始下降，这表明了HsCyPA基因参与了池蝶蚌的免疫系统的应激反应。3、利用PET-32a(+)表达载体，依据HsCyPA基因eDNA的序列，构建了含有完整开放阅读框(ORE)的表达载体并进行原核表达。经优化诱导条件后，亲和层析获得了含量较高的上清可溶性蛋白。糜蛋白偶联法显示HsCyPA蛋白具有PPLase酶活性。ELISA间接效价测定显示免疫大白兔所获得的多克隆抗体的效价为1：640000。这为进一步研究HsCyPA蛋白的功能提供了实验基础。本研究对CyPA基因在池蝶蚌免疫系统中承担的功能做了初步的研究，丰富了贝类免疫摘要系统中的防

5、御机制，为无脊椎动物免疫学的研究提供了一定的理论依据。关键词：池蝶蚌，CyclophilinA，Real．timePCR原核表达、多克隆抗体¨AbstractABSTRACTHyriopsisschlegelii,originatedintheLakeBiwaofJapan,wasintroducedtoChinain1997．Compared、析motherfreshwaterpeallmussel，the且schlegeliiisadvantageinrateofgrowth，disease—resistanceandbreed-pear

6、ling．Cyclophilinswithavarietyoffunctionshavebeenwidelyidentifiedindiverseorganismsfrommicroorganismstomammals．Ithastwoimportantfunctions，oneisthecis--transpeptidyl-prolylisomerase(PPlase)，whichcatalyticproteinfoldingandseversasmolecularchaperonesduringproteintransportproces

7、ses．TheothercansuppressimmunizationinTcell．CyPAwasthefirstnumberofCyclophilinsidentifiedin1984．RecentlyresearchsindicatedthattheCyPAgenemayplayallinlrnuneroleininfectiedorstressconditionsinsomespecies．Thefull—lengthCyPAeDNAofHyriopsisschlegelii(referredasHsCyPA)Wasidentifie

8、dfromeDNAlibraryofhaemocyteschallengedbyAeromonashydrophila．Toinvestigatethepossib