实验10肌糖原的酵解作用

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1、实验10肌糖原的酵解作用【实验目的】学习检定糖酵解作用的原理和方法，了解糖酵解作用在糖代谢过程川的地位及生理意义。【实验原理】在动物、植物、微生物等许多生物机体内，糖的无氧分解几乎都按完全相同的过程进行。本实验以动物肌肉组织屮肌糖原的酵解过程为例。肌糖原的酵解作用，即肌糖原在缺氧的条件下，经过一系列的酶促反应，最后转变成乳酸的过程。肌肉组织屮的肌糖原首先磷酸化，经过己糖磷酸酯、丙糖磷酸酯、甘油磷酸酯等一系列中间产物，最后生成乳酸。该过程可综合成下列反应式：l（CJiq.）a+HjO>2CH^CHOHCOOHB肌糖原的酵解作用是糖类供给组织能量的一种

2、方式。当机体突然需要大量的能量，而又供氧不足（如剧烈运动时），则糖原的酵解作用可暂时满足能量消耗的需要。在有氧条件下，组织内糖原的酵解作用受到抑制，而有氧氧化则为糖代谢的主要途径。糖原酵解作用的实验，一般使用肌肉糜或肌肉提取液。在用肌肉糜时，必须在无氧条件下进行；而用肌肉提取液，则可在有氧条件下进行。因为催化酵解作用的酶系统全部存在于肌肉提取液中，而催化呼吸作用（即三竣酸循坏和氧化呼吸链）的酶系统，则集中在线粒体中。糖原或淀粉的酵解作用，可由乳酸的生成来观测。在除去蛋白质与糖以后，乳酸可以与硫酸共热变成乙醛，后者再与对疑基联苯反应产生紫罗兰色物质，

3、根据颜色的显现而加以鉴定。该法比较灵敏，每毫升溶液含1-5pg乳酸即给岀明显的颜色反应。若有大量糖类和蛋白质等杂质存在，则严重干扰测定，因此实验中应尽量除净这些物质。另外，测定时所用的仪器应严格地洗干净。【实验试剂】1、1.5%对疑基联苯试剂：称取对疑基联苯1.5g,溶于100mL0.5%NaOH溶液屮，配成1.5%的溶液。若对耗基联苯颜色较深，应用丙酮或无水乙醇重结晶。此试剂放置时间长久后，会出现针状结品，应摇匀后使用。2、0.5%糖原溶液(或0.5%淀粉溶液)；3、15%偏磷酸(沉淀蛋白质终止反应)4、氢氧化钙(粉末)；5、浓硫酸；6、饱和硫酸

4、铜溶液：硫酸铜溶解度为20.7g(20°C)；7、1/15mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)。A、1/15mol/L磷酸二氢钾溶液：称量9.078gKH2PO4溶于蒸馅水中，于1000mL容量瓶屮稀释到刻度。B、1/15mol/L磷酸氢二钠溶液：称量11.876gNa2HPOi*21120(或23.894gNa2HPO4・12II20)溶于蒸徭水中，于1000mL容量瓶中稀释到刻度。8、液体石蜡(隔绝空气)【实验材料】兔肌肉糜。【实验器材】K试管1.5x15cm(x8)及试管架；2、移液管5mL(x2),2mL(xD,1mL(x2)；3、滴管；4、

5、量筒10mL(x4)；5、玻璃棒；6、恒温水浴；7、沸水浴。8、小台秤9、剪刀及银子10、漏斗"、冰浴12.表面皿13、橡皮塞14、滤纸。【操作方法】一、制备肌肉糜获取酶液将兔杀死后，放血，立即割取背部和腿部肌肉2.0g,在低温条件下用剪刀尽量把肌肉剪碎成肌肉糜。向肌肉糜内加入15mL磷酸缓冲液，搅拌均匀，以2500转/分钟离心，5分钟，收集上清液，即酶液（注意，应在临用前制备）。二、肌糖原酵解1、取4支试管，编号，按下表操作:1（试验管）2（试验管）3（对照管）4（对照管）酶液（mL）33330.5%糖原溶液（mL）111115%偏磷酸（mL）2

6、2摇匀液体石蜡（mL）1111将4支试管同吋放入37°C恒湿水浴中保湿1〜1.5小时15%偏磷酸（mL）222、0.5h后，取出试管，立即向1,2号管内加入15%偏磷酸溶液2mL,混匀。将各试管内容物分别以2500转/分钟离心5分钟，用滴管将液体石蜡小心弃掉，量取每个样品的上清液4mL,分别加入到已编号的试管中，然后向每管内加入饱和硫酸铜溶液1mL,混匀,再加入0.4g氢氧化钙粉末，塞上橡皮塞后用力振荡，放置30min,并不时搅动内容物，使糖沉淀完全。将每个样品分别以2500转/分钟离心5分钟，弃去沉淀。三、乳酸的测定1、取4支洁净、干燥的试管，编

7、号，每个试管加入浓硫酸1.5mL,将试管至于冷水浴中，分别用小滴管取每个样品的滤液1滴或2滴，逐滴加入到己冷却的上述浓硫酸溶液中（注意滴管大小尽可能一致），随加随摇动试管，避免试管内的溶液局部过热。2、将试管混合均匀后，放入沸水浴中煮5min,取出后冷却，再加入对疑基联苯试剂2滴，勿将对疑基联苯试剂滴到试管壁上，混匀试管内容物，比较和记录各试管溶液的颜色深浅，并加以解释。【注意事项】(1)对轻基联苯试剂一定要经过纯化，使其呈白色。(2)在乳酸测定屮，试管必须洁净、干燥，防止污染，影响结果。