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《利用流式细胞仪分选拟南芥根尖发育早期非根毛细胞》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、植物学报ChineseBulletinofBotany2010,45(4):460–465,www.chinbullbotany.comdoi:10.3969/j.issn.1674-3466.2010.04.009·技术方法·利用流式细胞仪分选拟南芥根尖发育早期非根毛细胞††**李斐,胡勇,王帆,张珍,刘祥林,白素兰,何奕昆首都师范大学生命科学学院,北京100048摘要建立了应用流式细胞仪分选植物特定类型细胞的方法。以拟南芥(Arabidopsisthaliana)Wer::GFP转基因株系为材料,用激光共聚焦显微镜鉴定GFP的表达位置,采用酶解法制备拟南芥根
2、尖原生质体,应用流式细胞仪荧光激活细胞分选技术(FACS)分选收集GFP阳性细胞,并提取细胞的RNA。结果表明,Wer::GFP转基因株系仅在根表皮发育早期的非根毛细胞中表达GFP;利用酶解法制备的根尖原生质体数目较多;从FACS分选收集的细胞中提取的RNA质量较好,可用于研究特定类型细胞的基因表达谱。应用流式细胞仪分选拟南芥非根毛细胞的方法为研究植物特定类型细胞的基因表达谱及基因功能奠定了技术基础。关键词拟南芥,流式细胞仪,荧光激活细胞分选,非根毛细胞,原生质体李斐,胡勇,王帆,张珍,刘祥林,白素兰,何奕昆(2010).利用流式细胞仪分选拟南芥根尖发育早期非根
3、毛细胞.植物学报45,460–465.流式细胞仪技术(flowcytometry)是一种对处在通过基因表达谱分析,寻找调控根毛发生与发育的候液流中的单个细胞或其它生物颗粒等进行快速定量选基因,研究它们在根毛发生与发育中的功能,最终分析和分选的技术。FACSAria是BD公司2003年推解析调控根毛发生及发育的分子机理。由于拟南芥根出的世界上首款台式高速多荧光检测和分选的流式毛是隔行发生(Masuccietal.,1996;Wadaetal.,细胞仪,其主要用途是从细胞群中高速分选出被指定1997;LeeandSchiefelbein,1999),需要将根毛细的细
4、胞,以便作进一步鉴定、功能研究或细胞培养。胞与非根毛细胞分别进行荧光标记,才能够利用流式目前,流式细胞仪分选技术已广泛应用于医学研究,细胞仪收集。本研究以在根尖发育早期的非根毛细胞但其在植物学领域的应用较少。中表达WEREWOLF(Wer)::GREENFLUORES-植物是由复杂的组织和器官构成,构成植物组织CENTPROTEIN(GFP)绿色荧光蛋白的拟南芥转基或器官的细胞又可以分为多种不同类型(Schereset因植物为材料,利用流式细胞仪分选该类型细胞,并al.,2002,2004;GalbraithandBirnbaum,2006)。植获得足够量的mR
5、NA,为建立特定类型细胞的基因表物的发育是通过调控基因表达及决定细胞命运而实达谱奠定技术基础。现的,因此建立不同类型细胞的基因表达谱对研究植物发育具有重要的意义(Birnbaumetal.,2003;Nawy1材料与方法etal.,2005;GalbraithandBirnbaum,2006;Zhang1.1植物材料etal.,2008)。要建立不同类型细胞的基因表达谱首先需要将不同类型的细胞分离开,然后收集所需细胞类野生型拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)为哥伦比亚生型并获得足够量的mRNA,才能够进行表达谱分析。态型(Columbia-0)
6、,由本实验室保存。拟南芥转基因为了研究拟南芥根毛发生及发育的分子机理,需要分植株Wer::GFP由美国密歇根大学JohnSchiefelbein别收集根尖发育早期的根毛细胞和非根毛细胞,然后教授馈赠。——————————————————收稿日期:2010-01-18;接受日期:2010-03-22基金项目:国家自然科学基金(No.30771094)和北京市自然科学基金(No.5082003)†共同第一作者。*通讯作者。E-mail:xlliu@mail.cnu.edu.cn;sulanb@sina.com李斐等:利用流式细胞仪分选拟南芥根尖发育早期非根毛细胞46
7、11.2主要试剂Sort,收起废液抽屉,调整侧液流窗的电压滚动条,使偏转的分选液流落入相应的收集管中。将主液流窗MS盐(SigmaM5519)、纤维素酶(SigmaC1709)、果中实际调出的Dmpl值添到默认窗口中。胶酶(SigmaP3026)、PI(propidiumiodide)、BME确定液滴延迟:运行仪器配套的标准质控物(β-mercaptoethanol)购于Sigma公司。RNeasyPlantAccrodropBeads,调整Dropdelay值。MiniKit购于Qiagen公司。cDNA第1链合成试剂盒、确定分选门:以野生型拟南芥根尖原生质体
8、作为Taq酶购于Taka
