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1、17卷4期生 物 工 程 学 报Vol.17No.42001年7月ChineseJournalofBiotechnologyJuly2001黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其在酵母中的高效表达113123周亚凤 张先恩 刘虹 张成刚AnthonyEGCass1(中国科学院武汉病毒研究所 武汉 430071)2(中国科学院沈阳应用生态研究所 沈阳 110015)3(BiochemistryDepartment,ImperialCollegeofScience,Technology&Medicine,Lo
2、ndon,SW72AY,UK)摘 要 将黑曲霉葡萄糖氧化酶(GOD)基因重组进大肠杆菌2酵母穿梭质粒pPIC9,转化甲基营养酵母Pichiapasto2risGS115,构建出GOD的高产酵母工程菌株。在酵母α2Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,黑曲霉GOD在甲基酵母中大量表达并分泌至胞外,经甲醇诱导3～4d,发酵液中的GOD活力可达30～40uPmL。SDS2PAGETM证实GOD在培养物上清中的含量显著高于其它杂蛋白,约占胞外蛋白总量的60%～70%,经QSepharoseFa
3、stFlow离子交换柱一步纯化即达电泳纯。重组酵母GOD比活达426163uPmg蛋白,是商品黑曲霉GOD的116倍。动力学-1性质分析表明,重组酵母GOD的Km和kcat分别为38125mmolPL和3492166s,与商品黑曲霉GOD相比,具有更高的催化效率。重组酵母GOD的高活力特性可有效提高葡萄糖传感器的线性检测范围。关键词 葡萄糖氧化酶,甲基酵母Pichiapastoris,基因表达,纯化,动力学分析,生物传感器中图分类号 Q789 文献标识码 A 文章编号100023061(2001
4、)0420400206 葡萄糖氧化酶(Glucoseoxidase,EC1.1.3.4,简1 材料与方法称GOD)消耗氧气催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸内酯,并释放出H2O2,广泛应用于蛋白脱糖、食品除氧1.1 材料及葡萄糖定量分析等,也是迄今为止生物传感器领1.1.1菌株和质粒:甲基营养酵母Pichiapastoris域最主要的工具酶。目前,GOD的大规模生产广泛GS115和质粒pPIC9为中国科学院上海生命科学院采用黑曲霉或青霉菌发酵,但黑曲霉和青霉菌发酵生物工程研究中心杨胜利教授馈赠。T载体和黑
5、曲生产GOD过程中,过氧化氢酶、纤维素酶及淀粉酶霉9029分别购自Promega公司和美国典型菌种保藏[1]中心(ATCC),其余菌株和质粒为本室保存或本工作等大量杂蛋白的存在给纯化带来相当的困难。因此,构建生产性能优良的GOD产生菌,研制及生产构建。E.coliDH5α作为受体菌用于质粒pPIC9、T高品质的GOD制剂,具有重要意义。FrederickK载体及它们衍生质粒的保存与扩增。[2][3]1.1.2 培养基:大肠杆菌的培养和转化用LB培养R和WhittingtonH分别在酿酒酵母中表达了黑
6、曲霉和青霉菌的GOD基因,获得了具有生物学活性基。酵母的培养、转化和蛋白的诱导生成用YPD、的酿酒酵母GOD。WittS等[1]试图在大肠杆菌中表MD、MM及RD等培养基。达GOD,但活力较低。甲基营养酵母Pichiapastoris培养基组成成分如下:-1表达系统为80～90年代发展起来的优良酵母表达LB(L):蛋白胨10g,酵母膏5g,氯化钠10g;[4]-1):蛋白胨20g,酵母膏10g,葡萄糖20g;系统,已成功地表达了数十种相关蛋白。本文采YPD(L-1用PichiapastorisGS1
7、15高效酵母表达载体,成功地MD(L):酵母基本氮源培养基(YNB)117g,硫构建了GOD高产酵母工程菌株,实现了GOD在甲酸铵5g,葡萄糖20g,生物素400μg;-1基酵母中的高效表达和分泌,并对重组酵母GOD和MM(L):YNB117g,硫酸铵5g,甲醇12mL,生商品黑曲霉GOD的性质进行了比较分析。物素400μg,酪蛋白水解物10g,pH516;收稿日期:2000212225,修回日期:2001204204。基金项目:国家自然科学基金资助(39870204)3通讯作者。Tel:86227
8、287641492;Fax:86227287641492;E2mail:x.zhang@pentium.whiov.ac.cn©1995-2005TsinghuaTongfangOpticalDiscCo.,Ltd.Allrightsreserved.4期周亚风等:黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其在酵母中的高效表达401-1RD(L):YNB117g,硫酸铵5g,葡萄糖20g,生离心去除沉淀。上清液经抽提去除蛋白后,用等体物素400μg,琼脂粉30g,山梨醇18414
