ITP患者NK细胞和嗜酸性粒细胞对自身血小板的细胞毒杀伤机制研究.pdf

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1、分类号：R558密级：公开学校代码：11065学号：Y0115130017专业博士学位论文ITP患者NK细胞和嗜酸性粒细胞对自身血小板的细胞毒杀伤机制研究作者姓名王术国指导教师赵洪国教授专业领域内科学（血液病）培养单位医学部临床医学系答辩日期2018年5月17日ITP患者NK细胞和嗜酸性粒细胞对自身血小板的细胞毒杀伤机制研究摘要目的原发免疫性血小板减少症是一种常见的获得性自身免疫性疾病。本病的特征是病人血小板减少而临床上没有明确的引起血小板减少的因素，表现为患者广泛的皮肤和黏膜出血，严重者可有内脏出血甚至颅内出血。通常使用皮质醇或者大剂量免疫球蛋白治疗可以快速增加血小板

2、数量，部分原发免疫性血小板减少症患者在接受激素及脾切除治疗后出现难治性，呈现临床高风险，对患者的生命造成了严重的威胁，因此有必要深入研究原发免疫性血小板减少症的发病机理，制定新的治疗策略。目前原发免疫性血小板减少症的发病机理主要观点是患者存在体液免疫异常，对自身血小板抗原免疫失耐受，患者体内产生针对血小板的自身抗体，血小板和自身抗体结合后，在网状内皮系统被巨噬细胞吞噬。近年来较多的证据显示原发免疫性血小板减少症有着多方面的发病机理，原发免疫性血小板减少症患者不仅存在体液免疫异常还存在细胞免疫功能紊乱。目前，自然杀伤细胞和嗜酸性粒细胞在原发免疫性血小板减少症发病机理中的研

3、究还较少，鉴于二者在细胞免疫中的重要作用，有必要进一步研究。在本研究中，我们探究自然杀伤细胞和嗜酸性粒细胞在原发免疫性血小板减少症发病中的作用，希望能够进一步完善该病发病机制的理论内容，为原发免疫性血小板减少症的治疗提供新的思路。为了验证自然杀伤细胞和嗜酸性粒细胞能否杀伤血小板以及分析其杀伤机制，本研究从四个方面进行。（1）研究自然杀伤细胞介导的细胞毒作用在原发免疫性血小板减少症发病机理中的作用。（2）研究嗜酸性粒细胞介导的细胞毒作用在原发免疫性血小板减少症发病机理中的作用。（3）通过检测原发免疫性血小板减少症患者自然杀伤细胞FasL、肿瘤坏死因子-α、颗粒酶B及穿孔素

4、的表达情况，探讨自然杀伤细胞杀伤血小板的可能机制。（4）通过检测原发免疫性血小板减少症患者骨髓中嗜酸性粒细胞阳离子蛋白表达水平，研究嗜酸性粒细胞杀伤血小板的可能机制。方法（1）采用Percoll密度梯度离心法初步分离16例原发免疫性血小板减少症患者和10例正常人骨髓中的自然杀伤细胞和嗜酸性粒细胞。（2）采用免疫磁珠阳性选择法进一步纯化自然杀伤细胞，通过流式细胞仪分析确定自然杀伤细胞比例>95%，台盼蓝染色检测自然杀伤细胞活性。采用免疫磁珠阴性选择法进一步纯化骨髓中的嗜酸性粒细胞。通过显微镜观察确定嗜酸性粒细胞比例>95%，台盼蓝染色检测嗜酸性粒细胞活性。（3）离心静脉血

5、获取血小板和血浆，通过显微镜下观察确定血小板比例>95%，台盼蓝染色检测血小板活性。（4）按照在孵育过程中细胞培养液是否添加受试者自身血浆，I将实验条件分为实验体系Ⅰ和实验体系Ⅱ，然后在两种条件下分别进行以自身血小板为靶细胞，自然杀伤细胞或者嗜酸性粒细胞为效应细胞的细胞毒实验。细胞毒实验后，使用流式细胞仪检测血小板的膜联蛋白ⅴ表达率以及自然杀伤细胞的FasL、肿瘤坏死因子-α、颗粒酶B和穿孔素的阳性表达率。（5）采用酶联免疫吸附法检测骨髓中的嗜酸性粒细胞阳离子蛋白表达水平。（6）应用SPSS21.0统计软件进行统计学分析。研究对象的实验数据（血小板凋亡率、NK细胞Fas

6、L表达率、NK细胞TNF-α表达率、NK细胞颗粒酶B及穿孔素的表达率）均为呈二项分布的百分数资料，对其取平方根反正弦变换，使其服从正态分布，经公式x′=arcsinP数据变换后，计算平均值±标准差（X±S），应用两独立样本T检验比较两组差异，P<0.01视为有显著性差异。结果第一部分实验：（1）在实验体系Ⅰ，血小板单独孵育6个小时后，血小板膜联蛋白V标记阳性率在原发免疫性血小板减少症患者组（0.193±0.027）和正常对照组（0.192±0.022）之间差异无统计学意义（t=0.202，P=0.842）。在实验体系Ⅱ，血小板单独孵育6个小时后，血小板膜联蛋白V标记阳

7、性率在原发免疫性血小板减少症患者组（0.206±0.187）和正常对照组（0.186±0.102）之间差异无统计学意义（t=0.908，P=0.373）。（2）在实验体系Ⅰ，血小板和自然杀伤细胞孵育6个小时后，原发免疫性血小板减少症患者组的血小板膜联蛋白V标记阳性率（0.368±0.025）明显高于正常对照组（0.193±0.021）（t=20.818，P<0.01）。在实验体系Ⅱ，血小板和自然杀伤细胞孵育6个小时后，血小板膜联蛋白V标记阳性率在原发免疫性血小板减少症患者组（0.194±0.027）和正常对照组（0.252±0.132）之