vegf165、bmp4基因复合生物活性玻璃组织工程骨的构建及修复骨缺损的研究

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1、万方数据中图分类号R6—83．4UDC610博士学位论文学校代码!Q5三3密级坌珏VEGF165、BMP4基因复合生物活性玻璃组织工程骨的构建及修复骨缺损的研究TheexperimentalinvestigationforestablishingcompoundtissueengineeringboneconsistingofgenesofVEGF165／BMP4andbioactiveglassanditseffectivenessforbonedefectrepair作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)

2、：指导教师：副指导教师：论文答辩日期杨明临床医学外科学湘雅二医院熊光仲教授卢畅教授答辩委员会主席蕴中南大学二。一三年四月万方数据原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者虢饵嘞进年且竺日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，

3、即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：导师签名兰竺生坤日期：畦年工月丑日万方数据VEGFl65、BMP4基因复合生物活性玻璃组织工程骨的构建及修复骨缺损的研究摘要背景骨缺损的治疗至今仍是骨科临床上的一个难题。目前最好的治疗方法依然是自体骨的移植，但是自体骨来源比较

4、有限，而且自体骨取材会给患者带来一定的痛苦及并发症，极大的限制了其临床应用。近年来，骨组织工程发展迅速，骨组织工程对骨缺损的治疗成为研究和临床应用的一个热点领域。组织工程骨诱导新生骨的形成和血管化问题已成为制约其临床应用的关键因素。骨形态发生蛋白(BMP)的新骨形成作用已被广泛认可，血管内皮生长因子(VEGF)是最为重要的促新生血管形成细胞因子。有研究发现，在骨缺损或骨损伤的修复过程中，BMP和VEGF都有大量的表达上调，并相互协同，共同修复缺损的骨组织。VEGF基因和BMP基因的联合应用，可以实现新生骨形成和骨血

5、管化的双重重建，是完善骨缺损修复的一个合理的研究思路和方法。利用缺陷型单纯疱疹病毒载体携带外源性的BMP及VEGF基因进入组织工程骨的种子细胞中，并使其与支架材料进行复合，组建BMP和VEGF双基因修饰的组织工程骨是目前国际上对骨缺损研究的一个热点。缺陷型单纯疱疹病毒载体具有安全、高效、稳定表达各生长因子基因的优点，目前开始应用于基因药物的研发中。目的(1)构建rdHSV-1一VEGFl65．BMP4骨缺损修复载体，并使其在种子细胞MSCs中大量共表达。(2)观察rdHSV-1．VEGFl65．BMP4与生物活性玻

6、璃(BG)复万方数据合后骨胶原蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶活性等指标，鉴定组织工程骨的体外成骨能力。(3)验证rdHSV-1．VEGFl65．BMP4复合BG材料的组织工程骨在修复骨缺损模型中的治疗效果。材料和方法(1)取人骨肉瘤成骨样细胞(MG．63)，并进行裂解处理，克隆出人BMP4基因及VEGFl65基因；对单纯疱疹病毒HSVl进行改造，组建缺陷型单纯疱疹病毒载体系统；将调取的BMP4及VEGFl65基因通过穿梭质粒载入单纯疱疹病毒载体，构建rdHSV-1一VEGFl65一BMP4病毒载体。(2)日本大耳白兔的骨

7、髓问质干细胞(Mscs)的分离、培养和体外增殖。(3)前3部分的实验分为两组：rdHSV-1．VEGFl65．BMP4实验组(或rdHSV-1一VEGFl65．BMP4与BG复合组织工程骨)和对照组，分别感染MSCs细胞；第4部分分为4组：rdHSV-1．VEGFl65．BMP4复合BG组(VEGFl65．BMP4组)、单纯生物玻璃组(BG组)、自体骨髓移植组(AB组)及对照组(CON组)，分别植入建立的兔桡骨缺损部位。(4)感染rdHSV-1．VEGFl65．BMP4病毒后48小时，通过间接免疫荧光、蛋白免疫印迹

8、反应、免疫组织化学、酶联免疫吸附实验等方法检测各组VEGFl65及BMP4基因的表达情况。(5)感染rdHSV-1一VEGFl65．BMP4两周后，对VEGFl65一BMP4实验组及对照组CON进行碱性磷酸酶活性含量的检测，骨胶原蛋白、骨钙素的检测以鉴定其成骨能力。(6)将感染rdHSV-1．VEGFl65．BMP4病毒的MSCs细胞与生物III万方数据玻璃