不结球白菜抗霜霉病基因的rapd标记的研究

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1、http://www.paper.edu.cn1不结球白菜抗霜霉病基因的RAPD标记的研究冷月强，侯喜林，史公军南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京（210095）E-mail：hxl@njau.edu.cn摘要：研究了与抗霜霉病基因紧密连锁的RAPD分子标记，利用不结球白菜抗病品种014和感病品种010杂交的F2群体为材料，通过人工接种鉴定，采用高抗单株和高感单株分别构建抗感病池，筛选了RAPD引物。结果表明：在所筛选的560条RAPD引物中有1条引物AY12在抗感病池中扩增出多态性片段AY121238，通过F2单株验证后，证明AY121238是与抗霜霉病基因紧密

2、连锁的，其遗传距离是6.7cM。关键词：不结球白菜，霜霉病，RAPD标记，遗传距离霜霉病（Peronosporaparasitica）是不结球白菜（Brassicacampestrisssp.chinensisMakino）三大病害之一，尤其是在春秋季节会造成大幅度的减产，连续使用杀菌剂又会降低其品质，因而选育和合理利用抗病品种是综合防治不结球白菜霜霉病的最佳途径，而快速准确的抗病[1,2]性鉴定技术是抗源材料筛选、抗病品种选育的基础。[3]Williams创立的随机扩增多态性DNA(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，RAPD)技术具有快速、简便、通用性

3、好，对DNA的需求量小，质量要求低等优点，现已广泛应用于各种生物的遗传多样性检测、基因定位、品系鉴定、遗传图谱的构建和系统学研究等各个方面。并且在辅助选择育种方面已取得很大的进展，已经定位了许多有价值的目标性状基因，包括抗线虫、抗病、雄性不育等，这些标记的产生对于提高选择的准确性和效率，缩短育种[4~6]年限，将产生很大的作用。与抗病基因紧密连锁的RAPD标记已在许多的蔬菜作物上应[7~9]用，但是有关不结球白菜抗霜霉病的分子标记至今还没有相关的报道，本文通过BSA的方法筛选与抗霜霉病紧密连锁的分子标记，为标记辅助选择提供理论基础。1.材料与方法1.1供试材料及试剂不结球白菜抗病

4、品种014和感病品种010（由南京农业大学园艺学院白菜课题组提供），及其F2群体；接种病原菌由田间感病品种病叶上采集得到。RAPD随机引物购于上海生工，dNTP、TaqDNA聚合酶均购于Takala公司。1.2试验方法1.2.1抗病鉴定将采回的病叶表面着生的霉层及其附着物用自来水冲净，再用蒸馏水冲洗，置于20℃黑暗条件下保湿（RH=95%）24h，用湿棉球将新产生的孢子囊轻轻剥落于蒸馏水中制成悬浮液，稀释至1×105个孢子/ml，标定浓度，最后加入标定体积的0.1%的吐温201本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（20030307021）和国家“863”计划（2003AA20

5、7120）的资助。-1-http://www.paper.edu.cn即成接种液。在不结球白菜4叶期进行人工喷雾接种，接种量为150~200μl/株，接种后黑暗保湿24h后，转移至自然条件下发病，1周后调查发病情况。1.2.2DNA提取及检测采用本实验室改良的CTAB法。取新鲜幼嫩叶片，在液氮中研磨成粉，移入2ml容积离心管中，加入（重量g/体积ml=1:3，65℃预热的）CTAB提取液[2%CTAB、0.1MTris-Hcl(pH8.0)，20mMEDTA-2Na（pH8.0），0.5%β-巯基乙醇]，快速混匀，65℃水浴70min，期间隔15min左右取出摇匀，加入等体积的氯

6、仿：异戊醇（24∶1）抽提2次。加入等体积异丙醇，冰上静置10min，离心，弃上清，加入500μl70%乙醇洗净，真空干燥10min后，溶于100μlTE，再加入10mg•ml-1RNase1μl，37℃保温1hr。4℃冰箱保存备用。采用DYY-Ⅲ-5型稳压稳流电泳仪，缓冲液为TAE的1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳时电压100V(5V/cm)，时间1h。电泳结束后在FR-200紫外可见分析装置检测，照相，并记录结果。1.2.3抗感病池的构建分别选取极端抗病和感病的F2单株，提取DNA后等量混合，形成抗感病池R（抗病池）和S（感病池），用于引物筛选。[4]1.2.4RAPD分析参照史

7、公军的方法，PCR反应体系为：在25μl反应体系中，1.9μldNTP(2.5mmol/L)，2μlMg2+(10mmol/L)，0.2μlTaqE(5U/μl)，1μlDNA(25ng/μL)，1μl50%甘油，1μlPrimer(10μmol/L)，2.5μl10×Buffer，13μlH2O；PCR扩增程序为：94℃变性2min，37℃退火30s，72℃延伸50s，2个循环；94℃变性45s，37℃退火30s，72℃延伸50s，72℃延伸5min，18个循环；94℃变性45