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1、2006年9月中国油料作物学报2006,28(3):251—256Chinesejournalofoilcropsciences甘蓝型油菜种子特异性表达fad2基因的ihpRNA载体构建陈松,张杰夫,陈峰,陈新军,龙卫华,浦惠明,戚存扣(江苏省农业科学院经济作物研究所,江苏南京210014)摘要:旨在通过转基因途径诱导油菜种子中fad2基因发生转录后基因沉默,本文构建了fad2基因的ihpRNA植物表达载体。通过PCR扩增分离到甘蓝型油菜种子特异性表达的Napin启动子序列(1147bp)以及油酸脱饱和酶基因(fad2)的一个537bp的片段,并将它们分别克隆到pGEM-Teasy载体中。利
2、用中间载体pHurrican构建fad2基因的反向重复框。将fad2基因片段以正向的方式连接在一个可剪切的内含子的5’末端,而以反向的方式连接到该内含子的3’末端;然后将Napin启动子序列连接到该反向重复框的5’端,而在其3’端接有一个nos终止子序列;最后将fad2基因的反向重复表达框分两步克隆到植物双元载体pCAMBIA2300的pUC18多克隆位点,构建具有种子特异性表达的fad2基因的ihpRNA表达载体pCNFIRnos。限制性内切酶酶切对载体作了鉴定分析。关键词:甘蓝型油菜;fad2基因;ihpRNA表达载体中图分类号:S565.4,Q943.2文献标志码:A文章编号:1007
3、—9084(2006)03—0251—06菜籽油的一个特点是多不饱和脂肪酸如亚油酸RNA基因沉默技术曾被SCIENCE杂志评选为(18∶2)和亚麻酸(18∶3)含量较高,尽管二者都是2002年度的最重大科学进步。RNA介导的基因沉人体所必须的脂肪酸,但其化学性质都很不稳定,易默在植物中被称作为转录后基因沉默,是双链RNA被氧化,产生对人体有害的物质。与亚油酸、亚麻酸诱导细胞内同源mRNA降解进而导致基因沉默的不同,油酸(18∶1)相对比较稳定,而且具有降低血过程。新近的研究发现双链RNA不仅能专一性地液胆固醇含量的特性。流行病学研究曾发现一些地引导mRNA的特异性降解,而且能诱导同源的DNA
4、序列甲基化。在植物体内表达特定基因序列的双链中海地区国家的居民长寿,心血管病和乳腺癌发病RNA分子,可以抑制或降低某些特定基因的表达。率较低,这与人们普遍食用富含油酸(18∶1)的橄[1]研究发现,带有柄环结构的双链RNA(hpRNA或ih2榄油密切相关。因此,降低食用菜籽油多不饱和pRNA)诱导的靶基因沉默,无论在诱导的频率上还脂肪酸含量,提高油酸含量已是油菜品质育种的重是在基因沉默的程度上均优于共抑制或反义RNA要目标之一。目前,国内外对双低油菜(低芥酸、低技术,ihpRNA诱导的靶基因沉默转基因植株其性状硫苷)品质育种中油酸含量的期望值是:由现在的[11,12]可以稳定遗传。因此,RN
5、A基因沉默技术已60%提高到80%以上。经发展成一种高效、可靠的抑制植物基因表达的新基因工程是获得高油酸种质的重要途径。油酸技术。脱饱和酶(Δ-12desaturase,FAD2)是植物产生多应用RNA基因沉默进行农作物分子育种研究不饱和脂肪酸的关键酶。通过转基因共抑制技术在国内处于起步阶段。本文报道以油菜fad2基因[2](油菜)(co-suppression)、反义RNA技术(油为靶标基因,构建具有种子表达特异性的ihpRNA[3～5]菜)或RNA基因沉默技术(棉花,拟南表达载体的研究结果,为开展农杆菌介导的遗传转[6～8]芥),抑制fad2基因表达阻止油酸脱饱和酶的化奠定实验基础。本研
6、究在国内未见报道。生成,控制油酸进一步脱氢生成亚油酸,提高油酸1材料与方法含量,同时降低亚油酸和亚麻酸含量。应用转基因共抑制技术和反义RNA技术在国内外报道较1.1供试材料[2～5,9,10]多。1.1.1植物材料甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)收稿日期:2005—11—25基金项目:农业部“948”项目(2003-Q4);江苏省农业科学院基金项目(6110508)作者简介:陈松(1963—),男,江苏泰州人,从事油菜分子育种研究工作。252中国油料作物学报2006,28(3)双低品种宁油16号,由江苏省农科院经济作物研究Bank检索到的序列AF243045,应用PrimerPr
7、emier所提供。5.0软件设计扩增特异性引物。PCR反应体系与扩1.1.2菌株大肠杆菌DH5α由武汉病毒研究所增条件同1.5。537bp的扩增产物克隆到pGEM-彭可凡先生惠赠。Teasy载体上,获得pGEMF载体。测序与blastn分1.1.3载体克隆有拟南芥(Arabidopsisthaliana)析同1.2.4。fad2基因内含子的pHurrican载体由澳大利亚fad2F15’AAGTGTTTGTC
