菘蓝直铁线莲宁B生物合成关键糖基转移酶基因的鉴定

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1、广东药科大学硕士研究生学位论文分类号：___________密级：__________UDC：___________菘蓝直铁线莲宁B生物合成关键糖基转移酶基因的鉴定姓名：谭宁萍学号：2111548077院系：中药学院学位类型：专业学位专业：中药学研究方向：中药资源开发与品质评价导师：黄璐琦研究员指导老师：唐金富副研究员论文提交日期：2018年3月15日论文答辩日期：2018年5月7日学位授予单位：广东药科大学二〇一八年五月广东药科大学硕士研究生学位论文Identificationofkeyglycosyltransfera

2、segenesinthebiosynthesisofclemastaninBfromIsatisindigoticaFort.Candidate：YupingTanStudentID：2111548077Affiliation：SchoolofGuangdongPharmaceuticalUniversityAcademicDegreeApliedfor：ProfessionaldegreeofPharmacySpeciality：PharmaceuticalAnalysisSupervisor：Prof.LuqiHuan

3、gAssistantSupervisor：Dr.JinfuTangDayofDefence：May2018Degree-Conferring-Institution：GuangdongPharmaceuticalUniversityMay2018广东药科大学硕士研究生学位论文广东药科大学学位论文原创性声明本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，系我个人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。除文中已特别加以标注和致谢的地方外，不包含其它个人或机构已经发表或撰写过的研究成果。对本研究做出贡献的其它个人和集体，均已在文中明确说明和

4、致谢。本人充分意识到本声明的法律结果完全由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文使用授权的声明本人完全了解广东药科大学有关保留和使用学位论文的规定，学校有权保留和向有关部门或机构送交本论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库，可以采用影印、缩印或其它复印手段保存和汇编本学位论文。保密论文在解密后适用本声明。论文作者签名：论文导师签名：日期：年月广东药科大学硕士研究生学位论文菘蓝直铁线莲宁B生物合成关键糖基转移酶基因的鉴定摘要菘蓝(Isatisindigotic

5、aFort.)为十字花科菘蓝属两年生草本植物。根为板蓝根、叶为大青叶来源之一，均为常用中药，具有清热解毒、凉血利咽之功效，临床上常用于流行性感冒、流行性腮炎、流行性乙型脑炎、急慢性肝炎、带状疱疹等疾病的治疗。菘蓝中所含的木脂素类化合物7S,8R,8′R-(+)-落叶松树脂醇-4,4′-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，即直铁线莲宁B(clemastaninB),对不同亚型人流感病毒与禽流感病毒均有显著抑制作用，是菘蓝抗病毒重要活性物质基础之一。然而，直铁线莲宁B在菘蓝原植物中含量较低，且主要存在菘蓝根部，含量-1最高仅为0.9

6、00mg·g（DW），这也在很大程度上限制了其在临床上的应用。因此，通过分子生物学等研究手段解析直铁线莲宁B生物合成途径，利用代谢工程调节菘蓝中直铁线莲宁B的含量或直接通过合成生物学策略合成这类化合物，对菘蓝药用资源的可持续利用具有重要意义。目前，参照模式植物拟南芥和其它植物的研究，菘蓝木脂素的合成途径已初步阐明，直铁线莲宁B生源合成途径上大多关键酶基因被陆续鉴定，但是催化关键糖基化修饰的糖基转移酶基因仍然没有被鉴I广东药科大学硕士研究生学位论文定。本研究基于菘蓝的转录组测序，筛选菘蓝直铁线莲宁B生物合成关键糖基转移酶并进

7、行进一步的功能研究。首先对菘蓝不同组织及其毛状根转录组测序分析，利用NCBI，KEGG，Swiss-prot，GO等数据库，注释直铁线莲宁B生物合成途径主要基因，并注释了120个糖基转移酶基因。据文献报道，UGT71、UGT72、UGT88家族的糖基转移酶可能催化苯丙素类生成相应的葡萄糖苷，对注释的UGT序列同源性比对，找到了14条属于这三个家族的糖基转移酶。克隆这14条候选UGT并构建重组原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达，分别提取粗酶用于体外酶促反应。以落叶松树脂醇为底物，筛选可以催化落叶松树脂醇生成直铁线莲宁B的糖基

8、转移酶，进而对筛选获得的糖基转移酶进行相关生化特性研究，同时构建菘蓝转基因毛状根体系进行体内验证，解析直铁线莲宁B生物合成的糖基化机制，为今后基于糖基转移酶的菘蓝代谢工程打下基础。主要结果如下：1.对菘蓝的转录组测序获得了基本转录组数据，利用NCBI公共数据库和KEGG对参与直铁线莲宁B生物合成途径的关