利用反义rna技术调节木质素生物合成的研究new

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1、首都师范大学硕士学位论文利用反义RNA技术调节木质素生物合成的研究——CCoAOMT和4CL基因对木质素生物合成的调控及C4H启动子的分离与鉴定姓名：路静申请学位级别：硕士专业：分子细胞生物学指导教师：何奕昆;宋艳茹20040601摘要木质素是一类酚类次生代谢产物，在植物体内行使重要的生理功能，但它却是形成造纸污染的主要来源。利用基因工程手段，在分子水平调节木质素的生物合成，降低木质素的含量或改变组分以培育适合造纸的植物原料树种具有较大的应用价值和环保效益。本研究利用反义RNA技术，主要围绕木质素合成途径中的咖啡酰辅酶A．O．甲基转移酶(CCoAOMT)和4．香豆酸：辅酶

2、A连接酶(4CL)的基因调节植物木质素的生物合成，研究取得了如下进展：1_农杆菌介导法将CCoAOMT和4CL基因的反义表达载体导入毛白杨中。PCR—Southern、RT—PCR和Western杂交检测结果显示，两个反义基因均已整合到毛白杨基因组DNA上，并在转录水平表达。通过分子生物学检测手段对转化植株进行筛选，获得批量转基因植株。Klason木质素含量测定分析表明，抑制内源CCoAOMT或4CL基因的表达，均能有效降低转基因植物中的木质素含量，且不影响植株正常生长和发育以及碳水化合物的合成。研究中还发现，转基因毛白杨的茎杆上一些区域呈红棕色，颜色的深浅与转基因毛白杨

3、木质素含量的下降幅度呈一定的正相关，因此，颜色变化可作为转基因植株筛选的一个辅助指标。已筛选出木质素含量下降10％以上的转CCoAi：驰[T基因毛白杨株系8个，最多降低26．20％；获得木质素含量下降10％以上的转4CL基因株系3个，下降最多达41．73％，可用于中试与制浆实验。该研究结果为培育低木质素环保型毛白杨提供理论与实践依据，也为从源头治理造纸废水污染奠定了基础。2．为了优化现有的表达框架，使目的基因更有效地调节木质素的生物合成，应用PCR技术从毛白杨(Populustomentosa)基因组中分离得到木质素合成相关酶一肉挂酸一4一羟化酶(C4H)基因启动予片段(

4、GenBank注册号：AY351673)。测序结果表明该启动子片段长1117bp，与杂交颤杨(Pkitakamiensis)C4H5’非翻译区的上游片段同源性为94％。序列分析结果表明，该启动子包含转录因子MYB的结合位点CACCAACC和转录因子Myb26结合位点GTTAGGTT等保守序列，这与C4H参与苯丙酸代谢合成途径的生物学功能相吻合。GUS荧光活性分析和组织化学染色结果显示，该启动子在木质化的组织和器官中特异表达，随着组织成熟度和木质化程度的增加，表达活性逐渐增强，并且该启动予受伤诱导表达。反义CCbAOMT基因在C4H启动子的调控下，使得转基因烟草木质素含量有

5、不同程度的减少，且并不影响碳向碳水化合物的转换合成，对植物的生长发育也无明显负效应。这些结果证明了从毛白杨中分离的C4H启动子可以应用于造纸原料树种材性改良的遗传工程操作。关键词：木质素生物合成反义RNAC4H启动子制浆造纸UAbstractLigninisaphenolicpolymerandplaysimportantrolesinplants，butisthemainresourceofpapermakingpollution．Thusthereisofeconomicalandenvironmentalinterestsincultivatingmaterials

6、withgeneticallymodifiedligninforpulpingindustry．TheeffectsofdownregulationoftwoligninrelatedgenesCCoAOMTand4CLexpressiononligninbiosyntheisisWerestudiedusingantisenseRNAtechniquesinthispaper．Thefollowingpresentsthemainpmgress：1．TwoantisenseexpressionvectorscontainingthecDNAofCCoAOMTor4CLg

7、enesweretransferredintoChinesewhitepoplarsmediatedbyAgrobacteriumtumefacience．PCR·SouthernanalysisindicatedthatantisensecDNAsintegratedintothegenomeofthetransgenicpoplars．TheantisensegenesexpressedattranscriptionalandtranslationalleveldisplayedbyRT-PCRandWesternbloa