水稻黑条矮缩病毒编码蛋白p7-2与寄住水稻蛋白互作研究

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ADissertationfortheDegreeofMasterInteractionofP7-2encodedbyRiceblack-streakeddwarfvirusandhostriceproteinsByShanglinZhangSupervisors:ProfessorJianpingChen&AssociateProfessorLiyingSunCollegeofPlantProtectionAnhuiAgriculturalUniversityHefei230036,P.R.ChinaZhejiangAcademyofAgriculturalSciencesHangzhou310021,P.R.ChinaJune,2013 本研究得到国家自然科学基金(31071660)，国家基础研究973项目(2010CB126203,2012CB722504)，公益性行业科研专项(2012DFA30900)，及“现代农业生物技术与作物病害防控”——浙江省高校重中之重学科建设资金资助研究工作在浙江省农业科学院“浙江省植物有害生物防控重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地”完成ThisstudywasfinanciallysupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(31071660),theStateBasicResearchProgramofChina(2010CB126203,2012CB722504),theInternationalScience&TechnologyCooperationProgramofChina(2012DFA30900)，theAgriculturalResearchProgramofChineseMinistryofAgriculture(201003031)andKeySubjectConstructionProgramofZhejiangforModernAgriculturalBiotechnologyandCropDiseaseControl.ThisworkwasdoneintheStateKeyLaboratoryBreedingBaseforZhejiangSustainablePestandDiseaseControl 中文摘要水稻黑条矮缩病毒（Riceblack-streakeddwarfvirus,RBSDV）是斐济病毒属的成员之一，可侵染玉米和水稻，引发玉米粗缩病和水稻黑条矮缩病，给亚洲水稻和玉米生产带来严重的损失。RBSDV的传播介体为灰飞虱（Laodelphgaxstriatellus），且该病毒在寄主植物和昆虫体内均可复制。寄主植物感病后主要症状为植株矮化、叶脉上出现肿瘤状突起等。RBSDV粒子呈正二十面体结构，具有双层衣壳，衣壳内部包含10条dsRNA基因组（S1~S10），可编码至少10个蛋白，并根据它们各自的基因片段命名。其中6个蛋白是病毒颗粒的结构成分（P1，P2，P3，P4，P8，P10），6个为非结构蛋白（P5，P6，P7-1，P7-2，P9-1，P9-2）。在非结构蛋白中，P7-1被认为可在昆虫介体细胞中参与形成管状结构，从而作为病毒胞间运动的通道。S9第一个ORF也编码一个重要的非结构蛋白P9-1，此蛋白在病毒侵染的植物或昆虫细胞中形成复制场所（毒质），是病毒复制所必需的。另外，S5编码的P5和S6编码的P6蛋白也为非结构蛋白，最近的研究表明这两个非结构蛋白与毒质的生物学活性相关。目前对P7-2的了解较少，其功能尚不明确。本研究采用分子克隆技术，首先从感染RBSDV浙江分离物的水稻叶片中扩增得到该病毒P7-2基因片段。将该基因亚克隆到原核表达载体pMAL-C2x中，将获得的重组原核表达质粒pMAL-P7-2在大肠杆菌BL21（DE3）中进行大量诱导表达。以纯化的融合蛋白MBP-P7-2为诱饵蛋白，通过Pull-Down实验在非变性条件下钓出感病水稻叶片总蛋白中的捕获蛋白。Pull-Down后的样品以空载体表达的标签蛋白MBP为阴性对照进行SDS-PAGE，检测到4个蛋白与目的蛋白特异结合，并进一步通过串联飞行质谱分析鉴定这些捕获蛋白。根据它们在RiceGenomeAnnotationProject中的序列比对分析，明确其中2个蛋白为转录相关蛋白，1个蛋白为氨基转移酶蛋白，1个蛋白为假定的分子伴侣60的前体。实时荧光定量PCR的数据分析表明，4个目的蛋白在感病水稻中的表达量与健康水稻中的表达量相比，转录相关蛋白和假定的分子伴侣60的前体的表达量增加，氨基转移酶蛋白的表达量降低。据此推测RBSDVP7-2蛋白可能具有转录激活活性，并且抑制寄主中氨基转移酶的表达，从而降低了寄主植物的抗病性。此外，我们应用了细胞原生质体转化体系对P7-2在植物细胞中的亚细胞定位进行了研究。将P7-2与eGFP的融合蛋白在拟南芥原生质体中进行表达。通过共聚焦显微镜观察发现，P7-2-eGFP融合蛋白在细胞核与细胞质中均有分布。由于DNA的转录过程主要是在细胞核中进行的，因此P7-2的亚细胞定位研究进一步加强了该蛋白可能具有转录激活活性的推测。另外，拟南芥原生质体转化体系的建立与改善为后续对P7-2在水稻原生质体中定位的研究奠定了基础。I 关键词：水稻黑条矮缩病毒，P7-2基因，蛋白质互作，实时荧光定量PCRII AbstractRiceblack-streakeddwarfvirus(RBSDV),amemberofthegenusFijivirus,infectsmaizeandriceplantsandcausessignificantyieldlossesofriceandmaizecropsinAsia.RBSDVistransmittedinnaturebythesmallbrownplanthopper(Laodelphaxstriatellus)andreplicatesincellsofbothhostplantsandinsectvectors.PlantswithRBSDVinfectionnormallyshowdwarfgrowthandproductionofwhitetumorsalongtheveinonthebackoftheleavesandonleafsheaths.RBSDVhasagenomeof10dsRNAs(S1~S10)encasedinicosahedraldouble-shelledparticlesandencodesatleast10primarytranslationproducts,whicharenamedfromtheirrespectivegenomesegments.Amongtheseproteins,six(P1,P2,P3,P4,P8andP10)arestructuralcomponentsoftheviralparticle,andanothersix(P5,P6,P7-1,P7-2,P9-1,andP9-2)arenon-structuralproteins.Amongofthosenon-structuralproteins,P7-1hadbeenidentifiedtoformthecytoplasmictubular-likestructuresthatserveasaconduitforvirionmovementbetweencellsintheinsectvector.TheORF1ofS9encodesanimportantnon-structuralprotein,whichcanformtheviroplasmincells.Moreover,P5andP6arerecentlystudyshowthattheyareassociatedwithbiologicalactivityofviroplasm.P7-2isexpressedinlowamountsandtheirfunctionsarestillunknown.Inthisstudy,takingadvantageofmolecularcloningtechniques,wefirstobtainedthecDNAofP7-2codingregionfromsegment7.ThefragmentofP7-2wasclonedintoprokaryoticexpressionvectorpMAL-C2x.TheresultingrecombinantplasmidpMAL-P7-2wasexpressedinE.coliBL21(DE3)strain.ThefurtherpurifiedfusionproteinMBP-P7-2waspreparedasabaitproteinandtotalproteinsofleavesofRBSDVinfectedriceplantswereextractedundernon-denaturingconditionsasthepreyproteins.WhenPull-downsampleswereanalyzedbySDS-PAGEandsilverstaining,fourproteinbandsweredetectedintheMBP-P7-2samplesbutnotintheMBPcontrol.Liquidchromatography-tandemmassspectrometry(LC-MS/MS)wasfurtherusedtoidentifythoseproteins.AccordingtothesequencealignmentinRiceGenomeAnnotationProject,twoofthemweretranscription-associatedprotein,onewasaminotransferaseprotein,andthelastonewasputativechaperonin60betaprecursor.Theexpressionlevelsoftranscription-associatedproteinandputativechaperonin60betaprecursorwashigherininfectedricecomparingwithhealthyriceusingreal-timefluorescencequantitativePCR.TheresultsindicatedthattheexpressionaminotransferaseproteinwassuppressedbyRBSDVinfection.Therefore,wesuggestedthatP7-2mayinterferehosttranscription，anditcouldreducetheresistanceIII ofthehostplantbyrepressingtheexpressionofaminotransferaseproteininhostplant.Inaddition,weexplorethesubcellularlocalizationofP7-2inplantcellsusingprotoplasttransformationsystem.P7-2wasfusedtoeGFPandexpressedinArabidopsisprotoplast.Confocallaserscanningmicroscopy(CLSM)observationrevealedthatP7-2-GFPfusionproteindistributedinbothnucleusandcytoplasm.TheDNAtranscriptionprocesswasmainlyinnucleus.Therefore,theresearchofsubcellularlocalizationofP7-2furtherconfirmedthespeculationthatthisproteinmayhastheabilityoftranscriptionalactivation.Moreover,establishingandimprovingtheArabidopsisprotoplasttransformationsystemlaidafoundationforfurtherstudyonthesubcellularlocalizationofP7-2inriceprotoplast.Keywords:Riceblack-streakeddwarfvirus,P7-2gene,Proteininteraction,Real-timefluorescencequantitativePCRIV 目录中文摘要.............................................................................................................IAbstract.............................................................................................................III文献综述............................................................................................................11水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）的生物学特点.........................................11.1RBSDV的发生及危害.............................................................................11.2RBSDV的症状及传播介体.....................................................................11.3RBSDV的分类地位.................................................................................11.4RBSDV粒子.............................................................................................32水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）分子生物学特点.....................................33蛋白质互作技术及Pull-Down原理简介..................................................54实时荧光定量PCR在检测植物基因表达中的应用................................6引言....................................................................................................................7材料与方法........................................................................................................91供试材料......................................................................................................91.1病样来源...................................................................................................91.2植物材料...................................................................................................91.3载体及菌株...............................................................................................91.4酶和化学试剂...........................................................................................91.5仪器设备...................................................................................................92实验方法....................................................................................................102.1引物的设计与合成.................................................................................102.2RBSDVP7-2基因的克隆......................................................................102.2.1Trizol法提取总RNA..........................................................................102.2.2RT-PCR.................................................................................................102.2.3PCR产物的纯化..................................................................................112.2.4连接反应..............................................................................................112.2.5大肠杆菌感受态细胞的制备..............................................................122.2.6重组质粒的热激转化..........................................................................122.2.7菌落PCR初步鉴定阳性克隆............................................................12V 2.2.8重组质粒的小量提取..........................................................................132.2.9重组质粒的双酶切鉴定......................................................................132.2.10序列测定和分析................................................................................132.3P7-2的原核表达及抗血清制备.............................................................132.3.1原核表达质粒构建..............................................................................142.3.2目的蛋白小量诱导表达......................................................................142.3.3SDS-PAGE检测..................................................................................142.3.4目的蛋白大量表达和包涵体的提取..................................................152.3.5目的蛋白的透析纯化与回收..............................................................152.3.6抗血清制备及检测..............................................................................152.4P7-2融合蛋白与水稻总蛋白Pull-Down..............................................162.4.1MBP-P7-2融合蛋白及MBP蛋白的大量诱导表达.........................162.4.2粗提感病水稻叶片总蛋白..................................................................162.4.3目的蛋白与水稻总蛋白Pull-Down...................................................172.4.4对照蛋白与水稻总蛋白Pull-Down...................................................172.4.5SDS-PAGE检测..................................................................................172.4.6蛋白质序列的测定及质谱分析..........................................................172.5寄主水稻互作因子基因表达的定量分析.............................................172.5.1水稻总RNA的提取............................................................................172.5.2逆转录..................................................................................................182.5.3引物的设计与合成..............................................................................192.5.4SqRT-PCR与qRT-PCR.......................................................................192.6P7-2在植物细胞中的亚细胞定位........................................................202.6.1引物的设计与合成..............................................................................202.6.2PCR扩增S7-2.....................................................................................202.6.3PCR产物的纯化..................................................................................202.6.4连接反应..............................................................................................202.6.5重组质粒的热激转化..........................................................................202.6.6菌落PCR初步鉴定阳性克隆............................................................202.6.7重组质粒的小量提取..........................................................................202.6.8重组质粒的酶切鉴定及序列测定......................................................202.6.9表达质粒构建......................................................................................212.6.10日本晴悬浮细胞体系的建立............................................................212.6.11拟南芥Col-0品种无菌苗培育.........................................................22VI 2.6.12去除细胞壁获得原生质体................................................................222.6.13原生质体的纯化................................................................................222.6.14重组质粒的原生质体转化................................................................222.6.15共聚焦显微镜观察............................................................................23结果与分析......................................................................................................241RBSDVP7-2的基因克隆及序列分析.....................................................241.1RBSDV基因组片段S7-2的扩增.........................................................241.2扩增产物的克隆和序列分析.................................................................242P7-2的原核表达及抗血清制备................................................................252.1原核表达质粒的构建.............................................................................252.2P7-2的原核表达及包涵体的提取........................................................262.3目的蛋白的纯化与回收.........................................................................262.4Westernblot检测抗血清效价................................................................273P7-2与寄主水稻蛋白的互作分析...........................................................283.1pMAL-P7-2与pMAL-C2x的大量诱导表达.......................................283.2Pull-Down后SDS-PAGE检测..............................................................283.3序列测定及质谱分析确定寄主互作因子.............................................284寄主水稻互作因子基因表达的定量分析................................................304.1RT-PCR调整cDNA浓度......................................................................304.2SqRT-PCR................................................................................................304.3水稻基因表达的定量分析.....................................................................305P7-2在植物细胞中的亚细胞定位...........................................................315.1S7-2基因的克隆.....................................................................................315.2重组表达质粒的构建.............................................................................325.3拟南芥原生质体中的荧光定位.............................................................325.4水稻原生质体细胞中GFP基因的表达................................................33讨论..................................................................................................................351RBSDVP7-2的基因克隆及序列分析.....................................................352RBSDVP7-2的原核表达及抗血清制备.................................................353P7-2融合蛋白与寄主水稻总蛋白的互作分析.......................................364寄主互作因子基因表达的定量分析........................................................375P7-2在植物细胞中的亚细胞定位...........................................................38全文总结及展望..............................................................................................40参考文献..........................................................................................................41VII 附录A：常用溶液及培养基配制方法..........................................................45致谢..............................................................................................................47作者简介..........................................................................................................48在读期间发表的学术论文..............................................................................48VIII 文献综述水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病自上世纪中期传入我国以来，给我国多个地区的水稻和玉米生产带来严重危害和经济损失。经研究证实这两种病害都是由水稻黑条矮缩病毒（Riceblack-streakeddwarfvirus,RBSDV）引起的[1,2]。培育筛选抗病品种是农业生产上防治该病毒较为理想的策略。近年来随着分子生物学技术的发展，已对该病毒的全基因组序列进行了测定，并对其基因组结构和编码相关蛋白功能有了初步的认识。本章拟从病害危害症状、传播介体、分类地位、病毒粒子结构和分子生物学等方面对RBSDV的研究历史和现状作一综述。1水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）的生物学特性1.1RBSDV的发生与危害水稻黑条矮缩病是一种危害水稻生产的病毒性病害，据报道1941年在日本第一次暴发流行，至今已成为东亚地区主要流行的水稻病害之一[1]。该病害在我国最早于1963年在浙江省余姚县的早稻上发现。20世纪90年代，水稻黑条矮缩病曾在浙江、江苏、安徽以及福建北部等长江流域中东部稻作区大面积暴发流行，局部地区病害发生率甚至超过90%，导致了严重的经济损失[3]。其病原水稻黑条矮缩病毒主要侵染水稻、玉米、小麦等禾本科植物，可以引起水稻黑条矮缩病、玉米粗缩病和小麦绿矮病。该病毒近年来在我国浙江、江苏、山东等多个水稻和玉米产区均有严重发生，给我国粮食作物生产带来严重危害[4]。1.2RBSDV的症状及传播介体RBSDV侵染水稻、玉米等寄主植物后，病株表现的明显症状为植株矮缩，叶片浓绿僵直，叶脉上出现肿瘤状突起，早期为蜡白色、后期为黑褐色，穗少甚至不抽穗，或结实不良[4,5]。水稻各生育期均受该病毒侵染，秧苗期及本田初期受侵植株症状表现明显。RBSDV主要由灰飞虱（Laodelphgaxstriatellus）以持久性的方式进行循环传播，感病种子不传毒，也不能以机械途径传播。介体一经染毒，终生带毒，但不能经卵传毒。RBSDV能够在灰飞虱体内经过循回期增殖，但介体并不表现明显的症状[6]。1.3RBSDV的分类地位RBSDV是呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus）第二组的成员。呼肠孤病毒的宿主范围比较广泛，可以感染人、脊椎动物、昆虫和植物。呼肠孤病毒科共分为九个属，其中侵染植物的呼肠孤病毒根据其宿主范围，传毒介体，粒子形态，核苷酸序列相关性等特征分为三个属：斐济病毒属（Fijivirus）、稻病毒属（Oryzavirus）和植物呼肠孤病毒属（Phytoreovirus）。斐济病毒根据寄主范围、传播介体、血清学1 和核苷酸序列相关性等，可分为5个组[7]（表1）。与RBSDV同属于第二组的有玉米粗缩病毒（Maizeroughdwarfvirus,MRDV）、MaldeRioCuartovirus（MRCV）、马塘草矮化病毒（Pangolastunvirus,PaSV）和南方水稻黑条矮缩病毒（SouthernRiceblack-streakeddwarfvirus,SRBSDV）。玉米粗缩病自20世纪中期传入我国，90年代后在华北，华东和西北地区对玉米生产危害逐年加重。起初玉米粗缩病和水稻黑条矮缩病被认为是不同病原物所引起。Zhang等[8]根据浙江省的水稻黑条矮缩病以及河北省的玉米粗缩病病毒分离物的病毒粒子大小形态、血清学关系、核苷酸序列比较等结果明确了我国发生的水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病的病原物均为RBSDV[8,9]。近年来在广东和海南地区，发生的一种新的水稻矮缩病，症状和水稻黑条矮缩病类似，表现为病株矮小，叶色浓绿，茎上有白色突起[10]，起初认为其病原是RBSDV，对其基因序列分析比对发现这是一种新的斐济病毒，暂命名为南方水稻黑条矮缩病毒[11,12]。而与RBSDV不同的是，南方水稻黑条矮缩病毒主要传毒介体为白背飞虱（Sogatellafurcifera）。表1斐济病毒属的分类、介体、寄主和分布Table1Fijivirusesandtheirhosts,vectorsanddistribution组别病毒介体寄主植物分布地区斐济病毒第一组飞虱禾本科澳大利亚(Fijidiseasevirus,FDV)水稻黑条矮缩病毒飞虱禾本科东南亚(Riceblack-streakeddwarfvirus,RBSDV)玉米粗缩病毒飞虱禾本科欧洲(Maizeroughdwarfvirus,MRDV)MaldeRioCuartovirus(MRCV)飞虱禾本科阿根廷第二组马塘草矮化病毒美洲南(Pangolastunvirus,PaSV)飞虱禾本科部、台湾南方水稻黑条矮缩病毒(SouthernRiceblack-streakeddwarfvirus,飞虱禾本科东南亚SRBSDV)燕麦不育矮缩病毒欧洲北部第三组飞虱禾本科(Oatsteriledwarfvirus,OSDV)和中部大蒜矮缩病毒第四组未知百合科法国(Garlicdwarfvirus,GDV)第五组褐飞虱呼肠孤病毒飞虱无日本2 (Nilaparvatalugensreovirus,NLRV)1.4病毒粒子RBSDV粒子特征符合斐济病毒粒子基本特征：完整的RBSDV粒子外观呈球状，为正二十面体结构，直径约为75nm，分子量约1.8x104kDa。病毒粒子由内外双层衣壳组成，无包膜，外层衣壳表面有12个突起，称为A-突起（A-spike），长和宽均约11nm；核心颗粒直径大约50nm，表面也有12个突起，称为B-突起（B-spike），长约8nm，宽约12nm。A-突起和B-突起都位于二十面体的垂直面上[7]。病毒粒子模型如图1所示。图1Fijivirus病毒粒子的形态模型[7]Fig1ModelofFijivirusparticle[7]O表示外壳；C表示核心；A表示外壳表面的突起；B表示核心表面的突起O,theoutershell;C,thecore;AandB,spikesonthesurfacesofoutershellandcore,respectively完整的病毒粒子具有较强的侵染能力[13]。但病毒粒子的外层衣壳极不稳定，容易脱去A-突起而形成带有B-突起的亚病毒粒子（Subviralparticle,SVP）[14]，B-突起可经1.9mol/LMgCl2处理后脱落，形成直径约为50nm的光滑的核心颗粒，其内部包含有10条双链RNA基因组[15]。最新研究表明RBSDV在寄主植物中的分布局限在寄主植物的韧皮部组织中，尤其集中在肿瘤细胞的细胞质中，但在介体昆虫体内，病毒的分布无组织特异性。RBSDV在寄主植物和介体昆虫细胞中均可产生管状结构和无膜包被的毒质（viroplasm），这两种特殊结构中会聚集大量的病毒粒子。免疫电镜观察发现，直径为50~55nm的病毒粒子（可能是未成熟的核心病毒粒子）聚集在毒质内，而完整的病毒粒子则分散在毒质外围，从而表明病毒毒质可能是病毒复制和组装的场所。2水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）分子生物学特性3 RBSDV的基因组由10条双链RNA（doublestrandRNA,dsRNA）组成，按其在聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）凝胶上由慢到快的迁移率依次命名为S1~S10[16]。每条dsRNA都具有保守的末端序列（+）5’-AAGUUUUU……AGCNNNNGUC-3’[17]。Zhang等[18]以浙江分离物为材料首次完成了对RBSDV10条基因组的全序列测定。随后Wang等[19]测定了RBSDV玉米分离物的全基因组序列，分析表明RBSDV的基因组全长约为30Kb，至少包含12个开放阅读框（Openreadingframe,ORF），编码6种结构蛋白和6种非结构蛋白。除片段S5、S7、S9外，其余七条基因组片段均为单顺反子，分别只能编码一个蛋白。S5含有两个部分重叠的ORF，S7和S9含有两个非重叠的ORF。通常情况下，双顺反子的第2个ORF的表达量较低，病毒有可能通过这种基因组织方式来调节病毒蛋白的表达量。目前对RBSDV的引起的症状观察，病原物鉴定、检测已经很完善，但对其致病机理和病毒编码蛋白的生物学功能的研究还有待进一步深入。借鉴其它呼肠孤病毒成员的研究结果，通过氨基酸序列同源性推测RBSDV基因编码的功能如下：S1全长4501nt，编码一个约为168.8kDa的蛋白，该蛋白具有RNA聚合酶的特征性结构域，推测其为RNA依赖性RNA聚合酶（RNAdependentRNApolymerace,RdRp）。S2全长3812nt，编码分子量为141.3kDa的病毒核心结构蛋白。S3全长3572nt，编码一个约132.0kDa的蛋白，可能为病毒粒子的核心结构蛋白，推测该蛋白可能具有鸟苷酸基转移酶（Guanylyltransferase）的功能[20]。S4全长3617nt，编码一个分子量为135.6kDa的外层衣壳上的B突起（B-spike）结构蛋白。S5全长3164nt，编码分子量分别为106.8kDa结构蛋白和26.5kDa的非结构蛋白，功能未知。S6全长2645nt，编码大小为89.6kDa蛋白，研究表明利用农杆菌浸润法以及重组的马铃薯X病毒（PVX）表达载体，发现该基因能强烈抑制转基因本生烟（16C）中由同源序列引起的GFP基因沉默，说明S6可能编码RNA沉默抑制子，并且和甜菜坏死黄脉病毒（BNYVV）的基因片段S14相比，RBSDV的S6基因对植株体内基因组DNA甲基化过程的抑制作用更为强烈[21]。S7全长2193nt，编码分子量分别为41.2kDa和36.4kDa的两个非结构蛋白P7-1和P7-2，血清学分析和细胞内定位结果显示P7-1为管状结构的组成成分[22]，P7-2功能尚不明确。S8全长1927nt，编码68.1kDa的病毒粒体的核心结构蛋白[23]。S9全长1900nt，编码分子量分别约为40kDa和24kDa的两个非结构蛋白P9-1和P9-2，P9-1已经被证实是组成病毒毒质（viroplasm）结构所需的最小病毒组分，在胞内形成毒质可以为病毒提供复制和组装的场所，因此该蛋白对于病毒生命周期的早期阶段起着十分重要的作用[24]，并且P9-1可与RBSDV编码的P6蛋白互作，由于P6可以自我互作形成类病毒基质结构（VLS），而P9-1通过与P6互作能够与P6共定位到VLS上[25]；P9-2功能目前尚不明确。S10全长1801nt，编码63.3kDa的外壳4 蛋白，酵母双杂交实验以及进一步的Westernblot分析验证显示，P10可以发生自我互作并可在体外形成聚合体[26]。RBSDV基因组及其功能汇总如下（表2）：表2RBSDV基因组编码蛋白及功能Table2ThegenomeorganizationandfunctionofRBSDV基因组全长阅读框等电点推测的蛋白质蛋白质功能片段（bp）（ORFs）（pH）分子量（kDa）S1450136-44308.00168.8RdRpS2381246-37265.97141.3亚病毒粒子外壳蛋白S3357214-34416.81132.0内层衣壳S4361734-35436.42135.6B-突起S5316416-2827106.8次要核心结构蛋白6.472378-307126.5非结构蛋白S6264581-24604.9789.6沉默抑制子、参与毒质结构S7219342-11306.0241.2管状结构1183-21124.8136.4非结构蛋白S8192725-18006.4768.1核心结构蛋白S9190052-10955.8839.9毒质结构1160-17894.9024.2非结构蛋白S10180122-16987.3963.3外层衣壳3蛋白质互作技术及Pull-Down原理简介蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、信号转导、蛋白质的合成与分泌、代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。蛋白质互作构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，采用现有的蛋白质互作的研究技术，通过未知蛋白与已知的蛋白发生相互作用，从而了解并推测未知蛋白可能具有的功能以及生物学意义。目前研究蛋白质相互作用的生物学技术有很多，如酵母双杂交系统、免疫共沉淀技术和Pull-Down度、避免蛋白质纯化、体现细胞内真实情况等优点，但也存在假阳性较高、只能检测定位于细胞核内的蛋白质间的相互作用、假阴性、融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能等局限性。免疫共沉淀得到的目的蛋白可信度高，也符合体内的真实情况，但存在两个缺陷。一是两种蛋白质的结合可能是间接的通过第三种蛋白在中间起的桥梁作用而发生结合，并不是二者直接的相互作用；二是目的蛋白需要在5 实验前被正确地预测，从而选择相应的抗体进行最后的检测。因此，若实验前的预测不正确就无法得到结果，方法本身具有一定的难度和冒险性。Pull-Down技术主要用来在体外鉴定重组蛋白与未知或已知蛋白之间的互作关系。其基本原理是将已标记的标签蛋白或诱饵蛋白特异性结合在处理后的层析柱中，再向柱子中加入目的蛋白溶液，能在其中诱捕到与其发生互作的捕获蛋白，将柱子中的总蛋白洗脱并收集，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，通过分析得到诱饵蛋白钓出的目的蛋白。诱饵蛋白可由原核表达得到细胞裂解物等多种方法获得。该技术具有的主要优点为假阳性极低，并且操作省时、方便，是体外研究蛋白质相互作用的常用技术手段。4实时荧光定量PCR在检测植物基因表达中的应用采用实时荧光定量PCR（Real-timefluorescencequantitativePCR,RTFQPCR）技术可以对植物生理变化时的基因表达量进行有效系统的检测，该技术已经成为确认整个基因组的微点阵数据或更小的一组基因的分子诊断的最常用的方法，它的出现彻底变革了对活体中基因表达的分析领域[27,28]。与传统的RT-PCR相比，它的主要优势在于高通量，灵敏度高，特异性强[29]。实时荧光定量PCR分析基因在不同阶段的表达量变化时，应当选取合适的内参基因作为对照，通过内参基因对数据的校正以提高该技术的灵敏性及可重复性。选择内参基因时，应确保内参基因能够在植物的不同生理时期的表达量相对稳定，从而使获得的实验数据和结果真实可信[30]。在实时荧光定量PCR反应中应用最广泛的荧光染料为SYBRGreenI，它能特异性的嵌合到所有的双链DNA中。该染料在游离状态下发出的荧光较弱，但若结合到双链DNA中，其荧光强度可增加到1000倍。因此，在PCR反应中随着时间的累积，产物DNA的数量不断增加，荧光信号强度也呈正比例增强[30,31]。并且该染料的成本相对较低，可满足临床和科研的需要。植物在不同生长时期，或是由于受到病害侵染时，其体内的某些基因以及蛋白质的表达量会相应的提高或降低。当植株受到病原物侵染时，植物本身可以通过调节部分基因的表达量，使相关具有抗病功能的基因表达上调，编码并分泌相应的蛋白质对病原物进行抵抗，从而激活植物的防御机制。病原物在寄主植物中通过编码相关的致病因子，可以增强或抑制寄主体内部分基因和蛋白质的表达。实时荧光定量PCR能够准确、灵敏的检测到目的基因在健康植株以及感病植株中的表达量。首先通过蛋白互作实验钓出与致病蛋白发生相互作用的寄主蛋白，然后采用实时荧光定量PCR进行验证，根据得到的实验数据分析出目的基因在植物健康和感病时表达量的变化。由于植物体内的目的基因的功能通常可以在相应的基因库中找到，因此根据实验结果分析出已知功能的基因的表达量的上调或下调，可以进一步推测病原物中的未知蛋白可能具有的生物学功能及相关的致病机理。6 引言水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病在我国分布广泛，病害流行时给我国水稻和玉米产区带来严重危害，带来了重大的经济损失。经证实该两种病害的病原物均为RBSDV[11]。RBSDV的寄主主要为禾本科植物，包括水稻、玉米、小麦等主要粮食作物，在我国分布极为广泛。由于该病害能致使病株生长发育受阻，结实率低，并且自上世纪中期传入我国以来，在全国多个地区流行发生，尤其在东南部沿海稻区和北方玉米产区发生频繁，给我国粮食生产造成重大的经济损失。RBSDV由昆虫介体灰飞虱传播，在防治上较为困难，而且在生产上尚缺乏有效抗RBSDV的品种，因此深入开展RBSDV的生物学和分子生物学的研究，对农业生产以及病害防治具有十分积极的作用。RBSDV是一种球状病毒，在分类上属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）、斐济病毒属（Fijivirus），其基因组为10条双链RNA，目前对RBSDV的基因组序列的测定已全部完成，对基因组编码部分蛋白功能的研究取得了一定的进展，尤其是一些结构蛋白相关的研究报道较多。RBSDV基因组片段S7全长2193nt，含有两个非重叠的ORF，ORF1是从42~44nt开始到1128~1130nt结束，ORF2从1183~1185nt开始到2110~2112nt结束，编码分子量分别为41kDa和36kDa的两个非结构蛋白P7-1和P7-2[22,32]。RBSDV侵染后可在寄主植物和昆虫细胞中，形成特殊的管状结构，此结构与病毒细胞间运动有关[33]，其主要的结构组成便是P7-1[22]。其基因组片段S7基因组第2个ORF编码的蛋白P7-2虽已知为非结构蛋白，但对其功能尚没有明确的研究报道。本研究以感染RBSDV的水稻浙江分离物为材料，对基因组片段7的第2个ORF进行了cDNA的克隆及序列分析。RBSDV全基因组可编码12个蛋白，其中6个为结构蛋白，6个为非结构蛋白。目前对RBSDV编码的蛋白质功能的认识还不完全，尤其对于大多数非结构蛋白的具体功能、致病机制以及精细调节机制还尚不明确。RBSDV编码的非结构蛋白P7-2经序列分析显示，其不同分离物之间是高度保守的，因此对P7-2蛋白的生物学功能开展一系列的研究，不仅能够深入了解非结构蛋白在病毒侵染、复制、诱导植物病症表达等细胞生理生化过程中所扮演的角色，而且能够藉此了解病毒的致病机理，为探索科学的病害防控提供理论依据。其中，制备病毒蛋白特异性的抗血清不仅是病毒蛋白功能研究过程中的一个重要环节，而且有可能用来发展病毒的快速检测方法，用于病毒流行的监测。生物体细胞内的蛋白质通常不是单独发挥生物学其作用，而是与其他蛋白质发生相互作用，形成蛋白复合物，在相关机制的启动和调控下行使特定的功能，进而承担起机体生命活动的基础[34]。病毒侵染寄主植物后，植物可以通过调节体内相关蛋白质7 的表达模式和相应酶类的活性，来启动机体内一系列的防御机制，识别外源病毒的侵染信号并实现生物学防御[35,36]。因此研究病毒与寄主植物的识别模式，从分子水平上探究病毒蛋白与寄主蛋白的相互作用关系及精细调节，对于揭示病毒与寄主的互作机制，以及推测未知病毒蛋白的生物学功能具有重要作用。本研究希望借助蛋白质互作技术，探索P7-2与寄主水稻蛋白的相互作用，以解决病毒可能存在的致病机制和寄主防御的分子机制等问题。明确寄主水稻中与病毒存在互作关系的因子可以为进一步深入了解P7-2蛋白的相关功能及在侵染水稻过程中的作用机制提供依据，为分析可能的病害防控机制奠定基础。8 材料与方法1供试材料1.1病样来源感染RBSDV的水稻病株种植于浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所气候室。1.2植物材料水稻粳稻品种日本晴（OryzasativaL.japonica.cv.Nipponbare）健康植株及感染RBSDV的植株种植于浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所气候室；拟南芥野生型品种Col-0植株种植于浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所温室；日本晴水稻愈伤组织由浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所严成其研究员惠赠。1.3载体及菌株载体：克隆载体pMD18-T为TaKaRa公司产品；原核表达载体pMAL-C2x和植物表达载体pZERO-eGFPc由本实验室保存。菌株：大肠杆菌（Escherichiacoli）DH5α、BL21（DE3），均为本实验室保存。1.4酶和化学试剂Macerozyme、Cellulase、Brij○R35solution30%购自Sigma公司；BamHI、SalI和PstI限制性内切酶购自TOYOBO公司；TaqDNA聚合酶、Trans2KTMDNAMarker、Trans2KTMplusIIDNAMarker购自TransgenBiotech公司；TrizolRNA提取试剂购自Invitrogen公司；T4DNALigase，PrestainedProteinMolecularWeightMarker购自FermantasMBI公司；Cocktail购自Roche公司；FastQuantcDNA第一链合成试剂盒（去基因组）购自TiangenBiotech公司；iQTMSYBRGreen○RSupermix购自Bio-rad公司；AmyloseResin购自BioLabs公司；IPTG、PCR凝胶回收试剂盒购自Promega公司；质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；其余试剂均为国产或进口分析纯。引物合成及测序均由上海博尚生物技术有限公司完成；蛋白质序列测定及质谱分析由上海中科新生命生物科技有限公司完成。1.5仪器设备PCR仪（Mastercyclerpersonal）、梯度PCR仪（MastercyclerepgradientS）、核算蛋白浓度分光光度仪、小型台式离心机（Centrifuge5415D、5417R）购自Eppendorf公司；大型卧式高速离心机购自BECKMAN公司；Real-timethermalcyclerCFX96、核酸电泳仪、蛋白电泳仪购自Bio-rad公司；激光共聚焦显微镜LeicaTCSSP5II购自Leica公司；UV-VisibleDiode-arraySpectrophotometer购自HewlettPackard（hp）公司；Milli-QBiocel纯水仪购自Millipore公司；制冰机（SIM-F124）、超低温冰箱（-40°C、-80°C）购自SANYO公司；以及水浴锅、超净工作台、摇床、恒温培养箱等常规仪器。9 2实验方法2.1引物的设计与合成根据已发表的RBSDV浙江分离物基因组片段S7-2序列（登录号AJ297427.1）分别设计上下游引物，由上海博尚生物技术有限公司合成，引物序列如下：P72_F:5’-CGGGATCCACCATGAATTACACTTTAGGTGATC-3，下划线为BamHI识别位点。P72_R:5’-GCGTCGACTTAAGAATTCAGTATCTTTTTGATCAAAG-3’，下划线为SalI识别位点。2.2RBSDVP7-2基因的克隆2.2.1Trizol法提取总RNA用Trizol法（Invitrogen公司）从水稻植株叶片中提取总RNA：（1）取100mg水稻病株组织样品，用液氮研磨成粉末，立即加入1mLTrizol，继续研磨成匀浆，转入1.5mL离心管中，冰置10min；（2）向离心管中加入200µL氯仿溶液（氯仿：异戊醇为24：1），剧烈振荡15sec，室温静置5min；（3）4°C，12,000g离心10min（溶液分层，底层为酚相，中层为蛋白相，上层是含RNA的无色水相），将上层水相转移至新的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min；（4）4°C，12,000g离心10min，弃上清，加入1mL的75%乙醇（DEPC处理水配制）洗涤沉淀，4°C，12,000g离心10min；（5）重复步骤（4）1次；（6）弃上清，在室温空气中干燥RNA沉淀10min，溶解于50µLDEPC水中。2.2.2RT-PCR逆转录方法参照FastQuantcDNA第一链合成试剂盒（去基因组）。取2μL总RNA，配制去除基因组DNA的混合液体系，彻底混匀。简短离心，并置于42°C孵育3min，然后置于冰上放置。基因组DNA去除体系如下：RNase-FreeddH2O6µL5×DNABuffer2μLTotalRNA2µL总体积10µL将基因组DNA去除后的反应液加入到反转录反应的混合液中，加入下游引物2μL，充分混匀，并置于42°C孵育15min。反转录反应体系如下：10 10×FastRTBuffer2μLRTEnzymeMix1μLP72_R2μLRNase-FreeddH2O5μL总体积10μL95°C孵育3min后置于冰上，加90μLddH2O稀释cDNA，-20°C保存。以获得的cDNA为模板进行PCR，PCR扩增体系如下：Temp1μLddH2O34μLcDNA2µL10×PCRBuffer5µLdNTP(10mM)5µLP72_F(20µM)1µLP72_R(20µM)1µLDNAPolymerase(5U/µL)1µL总体积10μLPCR流程为：94°C预变性2min后，作30个循环的扩增，每一循环包括94°C变性30sec，55°C退火30sec和72°C合成1min。循环结束后72°C延伸反应10min，16°C保存。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。2.2.3PCR产物的纯化PCR产物用凝胶回收试剂盒（Wizard○RSVGelandPCRClean-UPSystem，Promega）纯化，方法如下：（1）在UV凝胶扫描仪下用手术刀片将目的条带切下放在2mL离心管中，按一定比例加入BindingBuffer，置于58°C水浴10min，颠倒使其充分混匀；（2）将溶解的凝胶冷却至室温，转入柱子中，室温放置5min，14,000g离心1min；（3）弃滤液，加750µLWashingBuffer洗涤柱子，14,000g离心1min，弃滤液；（4）重复步骤（3）；（5）14,000g离心5min，甩干柱子中残留的WashingBuffer；（6）将柱子转入新的1.5mL离心管中，加入30~50µL无菌ddH2O，室温静置2min，14,000g离心2min以洗脱目的片段；回收的目的片段直接用于连接反应或-20°C保存备用。2.2.4连接反应将纯化的PCR产物连接到克隆载体pMD18-T上，参照TaKaRa公司说明书，10µL连接反应体系为：11 SolutionI5μLPCR产物4.5μLpMD18-TVector0.5μL总体积10μL4°C连接过夜，产物直接用于转化大肠杆菌感受态细胞或-20°C保存。2.2.5大肠杆菌感态细胞的制备（1）从LB平板上挑取新活化的EscherichiacoliDH5α单菌落，接种于2mLLB培养液中，37°C，230g摇菌过夜；（2）1:100转接至新的LB液体培养基中，37°C震荡培养，摇菌至OD600=0.5；（3）菌液冰置10min；（4）4°C，4,000g离心10min；（5）弃上清，用预冷的0.1MCaCl2重悬沉淀细胞并轻轻摇动；（6）4°C，4,000g离心10min；（7）弃上清，用预冷的0.1MCaCl2再次重悬沉淀；（8）4°C，4,000g离心10min；（9）弃上清，冰浴的0.1MCaCl2重悬菌体沉淀达到转化适宜浓度，并置于冰上加甘油至15%；（10）按每管100μL分装，液氮速冻，-80°C保存备用。2.2.6重组质粒的热激转化（1）从-80°C超低温冰箱中取出感受态细胞，置于冰上，待感受态细胞未完全融化时加入连接产物，轻叩管底混匀，冰上静置20min；（2）42°C水浴中热激90sec，立即冰上静置2min；（3）加入700μLSOC培养液，37°C，225g振荡培养1h；（4）室温条件下3,500g离心5min，取200μL上清重悬沉淀涂布于含相应抗性抗生素的LB平板，37°C倒置培养过夜至单菌落形成。2.2.7菌落PCR初步鉴定阳性克隆挑取单菌落进行平板划线，同时标上编号，于37°C培养。以每个单菌落为模板进行菌落PCR，筛选阳性克隆。反应体系如下：ddH2O7.7μL10×PCRBuffer1µLdNTPMixture(2.5mM)1µLP72_F(20µM)0.1µLP72_R(20µM)0.1µLDNAPolymerase(5U/µL)0.1µL总体积10μL12 PCR流程为94°C预变性2min后，作30~35个循环的扩增，每一循环包括94°C变性20sec，退火（根据计算的Tm和实际操作调整）20sec和72°C合成1min。循环结束后72°C延伸反应10min，16°C保存。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。2.2.8重组质粒的小量提取用质粒抽提试剂盒提取PCR鉴定为阳性的克隆质粒。按照OMEGA公司提供的说明书进行操作：（1）从选择培养基上挑取一个单克隆，接种至5mL含相应抗性的LB培养液中，37°C，225g振荡培养12~16h；（2）4,500g离心10min；（3）弃上清，加入250µL溶液I，充分悬浮菌体；（4）加入250µL溶液II，轻轻颠倒数次混匀，使菌体充分裂解，呈透明溶液，室温静置4min，使菌体完全裂解；（5）加入350µL溶液III，轻轻颠倒数次混匀，使蛋白完全变性出现白色絮状物；（7）14,000g离心12min；（8）小心吸取上清液至柱子中，室温放置2min，14,000g离心2min；（9）弃滤液，加入750µLWashingBuffer，14,000g离心1min；（10）弃滤液，加入500µLWashingBuffer，14,000g离心1min；（11）弃滤液，14,000g离心2min，以彻底去除结合柱中的乙醇残留；（12）将柱子转入新的离心管中，加入80µL无菌水于柱心，室温静置3min；（13）14,000g离心2min，洗脱DNA，测浓度，于-20°C保存备用。2.2.9重组质粒的双酶切鉴定10µL双酶切体系如下：SalI0.5µLBamHI0.5µLddH2O6µL10×Buffer1µLPlasmid2µL总体积10μL37°C恒温培养箱中中孵育2h，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的片段的插入。2.2.10序列测定和分析挑取2~3个阳性重组克隆进行序列测定后，用序列分析软件DNAMAN进行序列拼接以及比对分析。2.3P7-2的原核表达及抗血清制备13 2.3.1原核表达质粒构建经测序确证的重组克隆质粒pMD18-T-S7-2用BamHI和SalI双酶切，割胶回收目的基因。由本实验室保存的原核表达载体pMAL-C2x质粒同样用BamHI和SalI双酶切，回收载体片段。双酶切体系如下：SalI2µLBamHI2µLddH2O10µL10×Buffer4µLPlasmid22µL总体积40μLT4DNALigase将分别酶切后的目的基因P7-2和载体pMAL-C2x于16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布涂布含Amp+抗生素的LB平板，37°C恒温过夜培养后挑取单克隆，用P7-2_F/R引物进行PCR检测，筛选阳性克隆并提取质粒进行双酶切检测，确认目的基因是否正确连接到表达载体上。2.3.2目的蛋白小量诱导表达（1）取上述构建正确的重组质粒热激转入BL21-AI菌株，37°C，225g振荡培养1h后涂于含Amp+抗性的LB平板，37°C倒置培养过夜至单菌落形成；（2）挑取8个单克隆，接种于2mL含Amp+抗性的LB培养液中，37°C，225g振荡培养过夜；（3）1:100转接至3mL含Amp+抗性的LB液体培养基中，37°C，225g振荡培养1~2h至OD600=0.4~0.6；（4）加入1MIPTG至终浓度1mM，28°C，225g摇菌6h，并以不加IPTG的菌液作为阴性对照；（5）4°C，4,000g离心15min；（6）弃上清，加入1×BufferH，重悬沉淀；（7）液氮反复冻融3次；（8）4°C，14,000g离心10min；（9）移上清至新的1.5mL离心管中，上清和沉淀分别按照比例加入4×LoadingBuffer，100°C煮沸5min；（10）4°C，14,000g离心10min，于-20°C保存备用。2.3.3SDS-PAGE检测取上清10μL用12%SDS-PAGE电泳检测。聚丙烯酰胺凝胶（表3）用考马斯亮蓝R-250室温染色1h，转至脱色液，置于脱色摇床脱色至蛋白条带清晰，观察是否有特异蛋白的表达。14 表312%分离胶和5%浓缩胶配方（mL）Table3Theformationofseparationgel(12%)andenrichmentgel(5%)(mL)成分分离胶（12%）20mL浓缩胶（5%）10mL水6.66.830%丙烯酰胺8.01.71.5MTris-HCl(pH8.8)5.0—1.5MTris-HCl(pH6.8)—1.2510%SDS0.20.110%过硫酸铵0.20.1TEMED0.0080.012.3.4目的蛋白大量表达和包涵体的提取挑取融合表达的阳性单菌落接种到2mL含Amp+抗性的LB液体培养基中，于37°C摇床中培养过夜。次日以1:200稀释到新的250mLLB/Amp+液体培养基中，于37°C继续培养至OD600值为0.5~1.0，加入IPTG至终浓度为1mM，28°C诱导培养8h。12,000g离心15min集菌，沉淀用预冷的25mL缓冲液（50mMTris-HCl，0.25MNaCl，1mMDTT，1mMEDTA，pH8.0）重新震荡悬浮，加入25µL1mMPMSF和1mLcocktail置冰上超声破碎菌体（功率600~800W，破碎时间10sec，破碎次数10次，间隔时间30sec），4°C，12,000g离心10min后分别收集上清和沉淀。按如下步骤提取沉淀包涵体：（1）用40mLBufferH将沉淀重悬浮，加入40µLBrij35，4°C，12,000g离心15min，得到上清和沉淀，上清于-20°C保存；（2）用10mLBufferH重悬浮沉淀，加入浓度为8M的尿素，4°C，12,000g离心15min；（3）弃沉淀，用70mLBufferH稀释上清，4°C，8,000g离心30min，上清于-20°C保存；（4）用160mLBufferH重悬浮沉淀，12,000g离心15min，弃沉淀，上清于-20°C保存，SDS-PAGE检测蛋白大量诱导表达的上清和提取包涵体过程中保存的上清。2.3.5目的蛋白的透析纯化与回收（1）在所得的蛋白溶液中不断加入(NH4)2SO4固体，边加边搅拌直到饱和点为止，即(NH4)2SO4固体不再溶解；（2）10,000g离心30min，弃上清；（3）在沉淀中加入10mLBufferH，待沉淀溶解后转入透析袋中，透析袋用夹子夹紧；（4）将透析袋放入装有生理盐水（0.9%NaCl）的烧杯中，置于4°C透析纯化；（5）将纯化的蛋白溶液分装到离心管中，SDS-PAGE检测蛋白浓度与纯度后用于制备抗血清。2.3.6抗血清制备及检测按照1:1的比例将纯化的融合蛋白与弗氏佐剂混合、乳化，皮下多点注射免疫家15 兔，初次免疫后改用弗氏不完全佐剂，注射兔子后腿外肌肉肌肉肥厚处，并在颈后进行皮下三点注射。每两周加强免疫1次，效价达到要求后心脏取血，分离血清，-80°C保存备用。分别提取感染RBSDV的水稻和健康水稻的叶片蛋白，应用上述制备的P7-2蛋白抗血清进行Westernblot分析。提取水稻总蛋白方法如下：（1）称取0.08~0.1g叶片，液氮研磨成粉末；（2）加入BufferH和100µMPMSF，继续研磨；（3）转至1.5mL离心管中，4°C，14,000g离心15min；（4）将上清转移至新的离心管中，加入适量4×LoadingBuffer，100°C变性5min，取出后立即冰置5min；（5）4°C，12,000g离心10min，处理好的样品直接用于Westernblot检测。Westernblot方法如下：（1）电泳与转膜SDS-PAGE分离后的凝胶（不染色）置于转移缓冲液中浸泡数分钟，然后将已浸泡过的凝胶、硝酸纤维素膜、滤纸及海绵依次叠放在支架上，间隙之间不能有气泡。用半干转膜仪在18V恒压下转移20min。（2）封闭将转好的硝酸纤维素膜放入培养皿中，加入封闭液，室温条件下在摇床上缓慢封闭2h；（3）与一抗反应弃去封闭液，把膜放入用抗体稀释液稀释的抗血清溶液中，一抗稀释的倍数根据抗体效价的高低作适当的调整，一般按1:8,000的比例稀释，置于摇床上室温条件下反应2h。用TBS-T漂洗3次，每次10min；（4）与二抗反应弃去TBS-T，把膜放入抗体稀释液稀释的抗血清溶液中，二抗稀释的倍数根据抗体效价的高低作适当的调整，一般按1:10,000的比例稀释，置于摇床上室温条件下反应2h。（5）显示反应避光条件下，将经以上处理的硝酸纤维素膜置于NBT和BCIP的碱性磷酸缓冲液中，轻轻摇动显色至条带清晰，把膜放入蒸馏水中终止反应，并扫描纪录结果。2.4P7-2融合蛋白与水稻总蛋白Pull-Down2.4.1MBP-P7-2融合蛋白及MBP蛋白的大量诱导表达具体方法同2.3.4。2.4.2粗提感病水稻叶片总蛋白16 （1）称取适量感病日本晴水稻叶片，液氮研磨成粉末；（2）加入25mL1×BufferH，继续研磨，加入25×cocktail，抑制蛋白降解；（3）8,000g离心30min，弃沉淀；（4）将上清回收，10,000g离心15min，弃沉淀；（5）回收后的上清于4°C保存。2.4.3目的蛋白与水稻总蛋白Pull-Down（1）取一干净的多糖树脂柱，向柱子加入1.5mLAmyloseResin；（2）用1×BufferH洗柱子，洗3~5个柱体积，以除去AmyloseResin中的乙醇；（3）将大量诱导表达的目的蛋白上清溶液过柱，保证溶液缓慢滴入到柱子中；（4）用1×BufferH洗柱子，3~5个柱体积即可；（5）取100µL柱中的AmyloseResin，加入30µL4×LoadingBuffer，100°C变性5min，取出后于-20°C保存，以备检测；（6）将提取的感病水稻叶片总蛋白溶液过柱；（7）用1×BufferH洗柱子，3~5个柱体积即可；（8）取100µL柱中的AmyloseResin，加入30µL4×LoadingBuffer，100°C变性5min，取出后于-20°C保存，以备检测。2.4.4对照蛋白与水稻总蛋白Pull-Down以pMAL-C2x大量诱导表达的融合蛋白作为阴性对照，与水稻总蛋白Pull-Down，具体方法同2.4.3。2.4.5SDS-PAGE检测具体方法同2.3.3。2.4.6蛋白质序列的测定及质谱分析样品经SDS-PAGE检测后，对比目的蛋白和对照蛋白Pull-Down前后的条带，将目的蛋白Pull-Down后的特异性条带进行割胶回收，送上海中科新生命生物科技有限公司进行蛋白质序列的测定以及质谱分析。2.5寄主水稻互作因子基因表达的定量分析2.5.1水稻总RNA的提取采用振荡小样提取法从感病水稻和健康水稻叶片中提取植物总RNA，具体方法如下：1、取样匀浆（1）按样品数量，准备好RNase-Free的2mL离心管，并放入高温烘烤过的Solid-glassBeads；（2）选取鲜嫩幼叶75mg，放入离心管中，立即用液氮进行速冻处理；（3）将离心管放入用液氮预冷的振荡适配器中，置于振荡仪，安装并锁紧后，25Hz/s17 高速振荡1.5min破碎样品；（4）每管样品加入1mLTrizol；（5）匀浆后，室温（气温低时用25°C金属浴）放置5min；2、水相有机相分离（6）每管样品加入0.2mLCHCl3，手工振荡15sec；（7）室温（气温低时用25°C金属浴）静置5min后，4°C，12,000g离心15min；3、RNA提取（8）用200µL枪头缓缓吸取上清到一新的RNase-Free的1.5mL离心管；（9）加入等体积的Chloroform:IsoamylAlcohol，手工振荡15sec，静置5min，4°C，12,000g离心10min，取上清无色水相到一新的RNase-Free的1.5mL离心管中；（10）加入等体积Isopropanol，颠倒数次混匀，室温（气温低时用25°C金属浴）静置10min；（11）4°C，12,000g离心10min，弃上清，可见总RNA在管底的白色沉淀；4、RNA洗涤干燥（12）吸干残留的Isopropanol。调整移液器至200µL的刻度，吸取约180µL75%乙醇（RNase-Free），再吸取约20µL空气，轻轻搅动沉淀，直至RNA呈白色糊状后打入180µL75%乙醇，轻轻吹打，避免RNA粘在枪头上，以减少损失；（13）补充加入75%乙醇1mL，颠倒混匀，4°C，7,500g离心5min；（14）重复步骤（12），（13）；（15）弃上清，尽量吸干液体，真空浓缩干燥沉淀5~10min；（16）加DEPC-treatedWater20~30µL，溶解总RNA；（17）测RNA浓度，并通过RNA甲醛凝胶电泳确认RNA的质量，-80°C保存备用。提取过程中勤换手套及戴口罩，以免RNA的降解。2.5.2逆转录以提取的感病及健康水稻叶片总RNA为模板，参照FastQuantcDNA第一链合成试剂盒说明书进行逆转录。基因组DNA去除反应如下：RNase-FreeddH2O12µL5×DNABuffer4μL总RNA4µL总体积20µL将配制后的混合液充分混匀，简短离心，置于42°C，孵育3min。然后置于冰上放置。再配制反转录混合液，反转录反应体系如下：18 10×FastRTBuffer2μLRTEnzymeMix1μLP72_R2μLRNase-FreeddH2O5μL总体积10μL将配制好的逆转录反应的混合液加入到基因组DNA去除步骤的反应液中，充分混匀。置于42°C，孵育3min。再95°C孵育3min后置于冰上，加适量ddH2O稀释cDNA，-20°C保存。2.5.3引物的设计与合成根据Pull-Down中钓出的4个寄主水稻蛋白质的序列，在水稻基因库中找到相应的基因序列，分别设计4个基因的上下游引物，由上海博尚生物技术有限公司合成，引物序列如下：引物名称序列(5′to3′)P72_3641_F5′-AAGCATAAGGAAGTAACA-3′P72_3641_R5′-AATAGCATAACCAAGGAA-3′P72_3727_F5′-GTAGAAGTCGCCACAATA-3′P72_3727_R5′-CTCATCATCCAACAAGGT-3′P72_6006_F5′-TTGATAACGGTGTGATGG-3′P72_6006_R5′-CTGCTCTCCTTCTGATTG-3′P72_7515_F5′-TTGTTGGTGATGGCAGTA-3′P72_7515_R5′-TTCCTTCTCGTATTCTTGTTC-3′2.5.4SqRT-PCR与qRT-PCR以水稻肌动蛋白OsActin作为内参基因，调整cDNA模板浓度。以P72_3641_F/R，P72_3727_F/R，P72_6006_F/R，P72_7515_F/R，OsActin_F/R为引物进行半定量RT-PCR（Semi-QuantitativereversetranscriptionandpolymeraseChainreaction,SqRT-PCR）。反应体系如下：Temp1μLddH2O13.8μL10×PCRBuffer2µLdNTPMixture(2.5mM)2µLPrimer_F0.5µLPrimer_R0.5µLTaq0.2µL总体积10μLPCR流程为94°C预变性5min后，作27个循环的扩增，每一循环包括94°C变19 性30sec，58°C退火30sec和72°C合成30sec。循环结束后72°C延伸反应7min，16°C保存。1.0~1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。参照iQTMSYBRGreen○RSupermix试剂盒说明书，以P72_3641_F/R，P72_3727_F/R，P72_6006_F/R，P72_7515_F/R为基因引物，OsActin作为内参，经SqRT-PCR后的cDNA作为模板，进行实时荧光定量RT-PCR（QuantitativereversetranscriptionandpolymeraseChainreaction,qRT-PCR），反应体系如下：Temp1μLiQSYBRGreenSupermix5μLPrimer_F0.5µLPrimer_R0.5µLNuclease-freewater3µL总体积10µLPCR流程为：94°C3min；94°C20sec，55°C20sec，72°C30sec，作45个循环。使用Bio-RadReal-timethermalcyclerCFX96进行PCR反应及数据分析。2.6P7-2在植物细胞中的亚细胞定位2.6.1引物的设计与合成由于酶切位点不同，因此本研究第二章中获得的T载体重组质粒不能用于该实验。因此重新分别设计了上下游引物。由上海博尚生物技术有限公司合成，序列如下：E72_F：5’-CGGGATCCACCATGAATTACACTTTAGGTGATC-3’，下划线分别为BamHI识别位点。E72_R：5’-GCTGCAGAGAATTCAGTATCTTTTTGATCAAAG-3’，下划线分别为PstI识别位点。在设计引物时，去除了下游引物的终止密码子。2.6.2PCR扩增S7-2具体方法同2.2.2。2.6.3PCR产物的纯化具体方法同2.2.3。2.6.4连接反应具体方法同2.2.4。2.6.5重组质粒的热激转化具体方法同2.2.6。2.6.6菌落PCR初步鉴定阳性克隆具体方法同2.2.7。2.6.7重组质粒的小量提取具体方法同2.2.8。2.6.8重组质粒的酶切鉴定及序列测定20 10µL双酶切体系如下：PstI0.5μLBamHI0.5μLddH2O6µL10×Buffer1µLPlasmid2µL总体积10µL37°C恒温培养箱中中孵育2h，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的片段的插入。挑取2~3个阳性重组克隆进行序列测定。2.6.9表达质粒构建经测序确证的重组克隆质粒pMD18-T-S7-2用BamHI和PstI双酶切，割胶回收目的基因。由本实验室保存的表达载体pZero-eGFPc质粒同样用BamHI和PstI双酶切，回收载体片段。酶切体系如下：PstI2μLBamHI2μLddH2O10µL10×Buffer4µLPlasmid22µL总体积40µLT4DNALigase将酶切后的目的基因和载体片段16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布涂布含Kan+抗生素的LB平板，37°C恒温过夜培养后挑取单克隆，用E72_F/R引物进行PCR检测，筛选阳性克隆并提取质粒进行质粒PCR检测，确认目的基因是否正确连接到表达载体上。2.6.10日本晴悬浮细胞体系的建立（1）以日本晴成熟胚为试材诱导愈伤组织，取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，放入100mL无菌烧杯中；（2）倒入70%酒精消毒2min；（3）倒去酒精，加入100mL20%NaClO溶液，浸泡30min；（4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4~5遍，最后一遍侵泡30min；（5）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12~14颗；（6）操作完毕用封口膜（MicroporeTMSurgicalTape）封好培养皿，在28°C光照培养箱，培养3周；（7）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），置入继代培养基中，在28°C光照培养箱，适时更换培养液，继代培21 养1周；（8）在超净工作台上打开继代培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），置入悬浮培养基中，在28°C，150g水平摇床中避光培养，继代培养6~10天。2.6.11拟南芥Col-0品种无菌苗培育取适量种子装入1.5mL离心管，加入70%乙醇翻转30sec，将乙醇倒出后再加入种子消毒液浸泡10min，将溶液倒出，用无菌水洗5次，在无菌操作台上将种子均匀的平铺在MS固体培养基中，于25°C何文培养箱中培养14天左右，使苗子长出约4片叶子。2.6.12去除细胞壁获得原生质体（1）取一无菌空平板，用镊子夹取1~2g新鲜的无菌苗于平板中；（2）加入15mLTVL，将苗子切碎，尽量确保每个叶片有2~3个伤口；（3）将切碎的苗子转入经灭菌处理的200mL烧杯中；（4）室温，在黑暗中孵化30min；（5）将烧杯取出后，加入15mLEnzymeSolution，轻轻摇晃混匀，25°C在黑暗中静置4h，使纤维素酶和浸解酶与细胞充分接触，以去除细胞壁获得细胞原生质体。2.6.13原生质体的纯化（1）取一无菌的50mL离心管，加入20mLW5培养液，用纱布裹住封口，将原生质体缓慢倒入离心管中，对溶液中的苗子碎片等杂质进行筛滤，确保原生质体溶液一滴滴流入管中；（2）4°C，静置8h，使溶液分层，用移液枪将W5培养液与酶液中间层的原生质体取出，置于一新的50mL离心管中；（3）向原生质体中加入10mLW5培养液，室温，60g水平离心5min；（4）弃上清，加入10mLW5培养液，轻轻摇晃重悬浮细胞沉淀，室温，60g水平离心5min；（5）弃上清，根据沉淀细胞浓度加入1.5~3mLW5培养液，显微镜下观察原生质体的数量及完整性；（6）将原生质体放于冰上静置30min；（7）用移液枪除去溶液中的W5培养液，尽量在不碰到沉淀细胞的情况下将W5除净；（8）向原生质体中加入1.5mLMMG，于室温下备用。2.6.14重组质粒的原生质体转化（1）取一灭菌的2mL离心管，加入10~20µg重组质粒；（2）加入100µL原生质体溶液，轻轻混匀；（3）加入120µLPEG-Calcium转化溶液，轻轻摇晃使溶液充分混匀；22 （4）室温静置孵育10min；（5）加入400µLW5培养液稀释转化混合液，使转化过程停止；（6）室温，100g离心2min，弃上清；（7）向细胞沉淀中加入1mLW5培养液，室温下培养细胞24~48h。2.6.15共聚焦显微镜观察重组质粒转入至拟南芥原生质体1~2天后，弃去500µLW5培养液，置于共聚焦显微镜下，观察原生质体中绿色荧光的位置。23 结果与分析1RBSDVP7-2的基因克隆及序列分析1.1RBSDV基因组片段S7-2的扩增提取感病水稻组织总RNA，逆转录获得cDNA模板。以所设计的P7-2_F/R为引物进行RCR扩增，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示在约930bp位置处有非常明显的特异性扩增条带，与预期大小相符（图2）。所得PCR产物为编码P7-2的核苷酸片段。M1bp1000图2RT-RCR扩增的RBSDVP7-2cDNA片段Fig.2RBSDVP7-2fragmentamplifiedbyRT-PCRM.DL2,000DNAMarker；1.RBSDVP7-2的RT-PCR产物M.DL2,000DNAMarker;1.RBSDVP7-2fragmentamplifiedbyRT-PCR1.2扩增产物的克隆和序列分析切胶纯化后的PCR产物与pMD18-T载体连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含Amp+抗生素的LB平板，37°C恒温过夜培养后挑取单菌落小量扩繁，进行菌落PCR鉴定并提取质粒做双酶切鉴定，BamHI和SalI双酶切与菌落PCR扩增结果都与预期的大小一致（图3），表明RBSDVS7-2的基因组片段已经克隆成功，命名为pMD18-T-S7-2。选取2~3个阳性单菌落进行序列测定。序列分析表明，P7-2基因与GenBank中RBSDV浙江分离物S7基因序列（AJ297427.1）的同源性为100%。经DANMAN对蛋白结构的分析发现，P7-2含有11个α-螺旋，成稳定的球状结构，在靠近N端有结合小分子物质的能力。24 M12bp30001000图3重组质粒pMD18-P7-2的酶切鉴定Fig.3IdentificationofrecombinantpMD18-P7-2byendonucleasesdigestionM.DL8,000DNAMarker；1.重组质粒pMD18-P7-2；2.pMD18-P7-2质粒双酶切产物M.DL8,000DNAMarker;1.RecombinantpMD18-P7-2;2.DigestedfragmentofrecombinantpMD18-P7-22P7-2的原核表达及抗血清制备2.1原核表达质粒的构建将克隆载体上经测序确证的目的基因S7-2片段用BamHI和SalI进行双酶切，回收目的基因片段后连接经同样酶切回收的原核表达载体pMAL-C2x。连接产物转化大肠杆菌E.coliDH5α后筛选阳性单克隆，抽提重组原核表达质粒pMAL-P7-2，进行双酶切检测，目的条带与预期大小一致，约为930bp（图4），表明P7-2成功连入原核表达载体pMAL-C2x，获得重组质粒pMAL-P7-2。M123bp80001000图4重组质粒pMAL-P7-2的酶切鉴定Fig.4IdentificationofrecombinantpMAL-P7-2byendonucleasesdigestionandPCRM.DL8,000DNAMarker；1.重组质粒pMAL-P7-2扩增产物；2.重组质粒pMAL-P7-2；3.pMAL-P7-2质粒双酶切产物M.DL8,000DNAMarker;1.RecombinantpMAL-P7-2amplifiedbyPCR;2.RecombinantpMAL-P7-2;3.DigestedfragmentofrecombinantpMD18-P7-225 2.2P7-2的原核表达及包涵体的提取重组质粒pMAL-P7-2热激转化至表达菌株BL21，经IPTG小量诱导表达后，进行SDS-PAGE检测，检测结果显示仅在沉淀中发现目的蛋白，说明此蛋白为包涵体的形式在细胞中表达。将重组质粒重新进行大量诱导表达以提取沉淀中的包涵体，将提取过程中回收的含有不同浓度尿素的上清溶液进行SDS-PAGE检测，在浓度为1MUrea（尿素）的上清中检测到特异性表达且浓度和纯度较高的目的蛋白，并在原核表达后的上清溶液中检测到符合pMAL-P7-2融合蛋白分子量大小的特异性条带（图5）。该蛋白在小量诱导表达时并未检测到，而在大量诱导时检测到蛋白表达，可能是受到诱导温度和时间的影响。M12345kDa85图5包涵体中蛋白样品SDS-PAGE检测Fig.5ProteinsintheinclusionbodybySDS-PAGEM.Proteinmolecularweightmarker；1.P7-2蛋白上清；2.沉淀中蛋白稀释物；3.8MUrea的蛋白溶液；4.1MUrea的蛋白溶液；5.1/160MUrea的蛋白溶液M.Proteinmolecularweightmarker;1.SupernatantofP7-2;2.Dilutionofproteininprecipitation;3.Proteinsolutioninclude8MUrea;4.Proteinsolutioninclude1MUrea;5.Proteinsolutioninclude1/160MUrea;2.3目的蛋白的纯化与回收上述含有1MUrea融合蛋白的上清溶液经过硫酸铵盐析后，析出的蛋白沉淀用生理盐水透析纯化，以不同浓度的BSA为对照，SDS-PAGE检测到特异性表达一个分子量约为85kDa的融合蛋白，符合理论推算的目的融合蛋白分子量（MBP-tag分子量约为50kDa，目的蛋白分子量约为36kDa），蛋白浓度与0.1%BSA相近（图6）。其纯度与大量诱导表达的上清蛋白的纯度相比较高，杂蛋白条带较少且浓度较低，利于制备免疫抗血清。26 M1234kDa85图612%SDS-PAGE检测包涵体中蛋白样品Fig.612%SDS-PAGEofproteinsintheinclusionbodyM.Proteinmolecularweightmarker；1.纯化的pMAL-P7-2融合蛋白；2.1%BSA；3.0.1%BSA；4.0.01%BSAM.Proteinmolecularweightmarker;1.ThepurifiedfusionproteinofpMAL-P7-2;2.1%BSA;3.0.1%BSA;4.0.01%BSA2.4Westernblot检测抗血清效价将提取包涵体中的目的融合蛋白MBP-P7-2进行纯化回收，通过免疫家兔获得抗血清。提取感病水稻叶片中的可溶性总蛋白和健康水稻叶片中的可溶性总蛋白，选择血清1/2000的浓度来进行Westernblot检测（图7）。M1234kDa8535图7感病水稻叶片中P7-2的Westernblot分析Fig.7DetectionofP7-2ininfectedriceleavesbyWesternblottingM.Proteinmolecularweightmarker；1.健康水稻样品；2.感染RBSDV的水稻样品；3.诱导的空菌株；4.诱导表达的含pMAL-P7-2菌株M.Proteinmolecularweightmarker;1.Healthyriceplant;2.RBSDV-infectedricesample;3.E.coli.BL21plysSnotcontainingpMAL-P7-2;4.E.coli.BL21plysScontainingpMAL-P7-2以原核表达中的融合蛋白MBP-P7-2以及空载体表达的标签蛋白MBP分别作为阳性对照和阴性对照。结果显示，感病水稻叶片总蛋白与血清产生的特异性免疫印记27 位置约为35kDa，符合P7-2蛋白的理论预期大小；原核表达中的目的蛋白由于含有MBP标签，分子量为50kDa，因此融合蛋白的分子量约为86kDa，理论上与免疫印记的位置相符。3P7-2与寄主水稻蛋白的互作分析3.1pMAL-P7-2与pMAL-C2x的大量诱导表达为确保Pull-Down实验钓出的寄主互作蛋白并非与载体基因的表达产物存在互作关系，我们以空载体蛋白作为阴性对照，将重组质粒pMAL-P7-2与空载体质粒pMAL-C2x分别热激转入大肠杆菌BL21菌株，28°C经IPTG诱导8h后集菌，分别用25mL1×BufferH重悬浮沉淀，经超声破碎后得到蛋白粗体物，离心后对上清蛋白溶液进行SDS-PAGE检测，目的基因S7-2的原核表达产物在约85kDa处有特异性条带，与预期大小相符（图8）。M12kDa85图8pMAL-P7-2和pMAL-C2x原核表达的融合蛋白Fig.8FusionproteinofpMAL-P7-2andpMAL-C2xbyprokaryoticexpressionM.Proteinmolecularweightmarker；1.pMAL-C2x融合蛋白；2.pMAL-P7-2融合蛋白M.Proteinmolecularweightmarker;1.FusionproteinofpMAL-C2x;2.FusionproteinofpMAL-P7-23.2Pull-Down后SDS-PAGE检测将大量诱导表达的目的蛋白和对照蛋白溶液分别结合到含有麦芽糖结合蛋白（MBP）的多糖树脂柱中，使融合蛋白固定在柱子中。提取感病水稻叶片总蛋白进行Pull-Down后，分别取100µL柱子中的AmyloseResin进行SDS-PAGE检测（图9）。为便于观察目的蛋白P7-2在Pull-Down后与PullDown前相比而出现的特异性条带，取融合蛋白P7-2与水稻总蛋白Pull-Down前柱中的AmyloseResin一起经SDS-PAGE检测（图10），根据与对照蛋白和Pull-Down前的蛋白样品比较，在PAGE胶上找到5个特异性条带，分子量的大小依次约为90kDa、80kDa、70kDa、50kDa和40kDa，割胶后送上海中科新生命生物科技有限公司进行蛋白质序列的测定。3.3序列测定及质谱分析确定寄主互作因子经测序的5个蛋白样品，通过质谱中的核质比分析（图11），筛选得到4个蛋白。将这4个蛋白的氨基酸序列放在RiceGenomeAnnotationProject中进行比对，分别得到28 相应的水稻蛋白信息，其中2个为转录相关蛋白，1个为氨基转移酶蛋白，1个推测为分子伴侣60的前体。M12kDa85图9pMAL-P7-2和pMAL-C2x融合蛋白与水稻总蛋白Pull-Down后检测Fig.9SDS-PAGEoffusionproteinofpMAL-P7-2andpMAL-C2xPull-DownwithricetotalproteinM.Proteinmolecularweightmarker；1.pMAL-C2x融合蛋白；2.pMAL-P7-2融合蛋白M.Proteinmolecularweightmarker;1.FusionproteinofpMAL-C2x;2.FusionproteinofpMAL-P7-2M1234kDa85图10SDS-PAGE检测目的蛋白与对照蛋白的差别Fig.10SDS-PAGEofthedifferenceofthetargetproteinandthecontrolproteinM.Proteinmolecularweightmarker；1.P7-2与水稻蛋白Pull-Down后；2.P7-2融合蛋白单独过柱；3.原核表达中P7-2蛋白上清；4.pMAL-C2x融合蛋白与水稻蛋白Pull-Down后M.Proteinmolecularweightmarker;1.P7-2Pull-Downwithriceproteins;2.TheonlyP7-2fusionproteinbindingtothecolume;3.SupernatantofP7-2byprokaryoticexpression;4.FusionproteinofpMAL-C2xPullDownwithriceproteins29 图11水稻蛋白质的串联飞行质谱分析Fig.11Tandemflightmassspectrometryofriceproteins4寄主水稻互作因子基因表达的定量分析4.1RT-PCR调整cDNA浓度提取日本晴感病及健康水稻叶片中总RNA，参照FastQuantcDNA第一链合成试剂盒（去基因组）进行逆转录反应，选择水稻肌动蛋白OsActin作为内参基因，以OsActin_F/R为引物进行半定量RT-PCR，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。根据检测结果显示出的特异性条带亮度差异，在亮度较高的cDNA模板中加适量纯水稀释，通过琼脂糖电泳检测结果及进一步调试最终使cDNA模板达到基本一致的亮度（图12a），即在模板cDNA在内参基因OsActin表达量一致的情况下，作为进一步半定量PCR以及实时荧光定量PCR的模板使用。4.2SqRT-PCROsActin为内参基因的两个cDNA模板的初始拷贝数基本一致，因此该浓度的cDNA可以作为半定量PCR的模板。以浓度一致的cDNA为模板，OsActin为内参，P72_3641_F/R，P72_3727_F/R，P72_6006_F/R，P72_7515_F/R和OsActin_F/R为引物进行半定量PCR，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示（图12a），4对引物均可通过PCR扩增出特异性条带，说明引物可用于定量PCR实验中。4.3水稻基因表达的定量分析模板cDNA在内参基因OsActin表达量一致的情况下，以P72_3641_F/R，P72_3727_F/R，P72_6006_F/R，P72_7515_F/R和OsActin_F/R为引物进行实时荧光定量PCR。结果显示（图12b），具有转录相关功能的蛋白3641和3727在感病水稻中的表达量与健康水稻中的表达量相比均有明显增加，氨基转移酶蛋白6006在感病水稻中的表达量与健康水稻中的表达量相比减少，假定的分子伴侣60的前体7515在感病水稻中的表达量与健康水稻中的表达量相比略微增加。30 图12水稻基因半定量与定量验证Fig.12SqRT-RCRandRTFQPCRofricegene（a）：水稻基因半定量PCR验证，H：健康的日本晴水稻植株cDNA；W：感染RBSDV的日本晴水稻植株cDNA（b）：水稻基因定量PCR的验证，H：健康日本晴水稻叶片中的基因表达量；W：感染RBSDV的日本晴水稻叶片中的基因表达量（a）：SqRT-PCRofricegene,H:cDNAinhealthyrice;W:cDNAininfectedrice.（b）：qRT-PCRofricegene,H:geneexpressioninhealthyrice,W:geneexpressionininfectedrice.5P7-2在植物细胞中的亚细胞定位5.1S7-2基因的克隆以本研究构建的pMD18-P7-2为模板，E72_F/R为引物进行RCR扩增，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，特异性目的条带约930bp（图13），与预期相符。切胶纯化后的PCR产物与pMD18-T载体连接，产物经转化后进行菌落PCR鉴定，将筛选到的阳性单菌落送去测序。M1bp1000图13RCR扩增P7-2cDNA片段Fig.13P7-2fragmentamplifiedbyPCRM.DL2,000DNAMarker；1.RBSDVP7-2的PCR产物M.DL2,000DNAMarker;1.RBSDVP7-2fragmentamplifiedbyPCR31 5.2重组表达质粒的构建将克隆载体上经测序确证的目的基因用BamHI和PstI双酶切，回收目的基因后连接经同样酶切回收的表达载体pZero-eGFPc。连接产物转化大肠杆菌E.coliDH5α后筛选阳性单克隆，抽提重组表达质粒，进行质粒PCR，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物的特异性条带位置与预期一致（图14），表明P7-2成功连入表达载体pZero-eGFPc，获得重组质粒。绿色荧光标签eGFP在C端，因此在设计引物时去掉了目的基因的终止密码子，以确保eGFP蛋白的表达。M123bp80001000图14重组质粒pZero-eGFPc-P7-2的质粒PCR鉴定Fig.14IdentificationofrecombinantpZero-eGFPc-P7-2byplasmidPCRM.DL8,000DNAMarker；1.eGFPc-P7-2质粒PCR；2.pZero-eGFPc质粒；3.eGFPc-P7-2质粒M.DL8,000DNAMarker;1.eGFPc-P7-2plasmidPCR;2.pZero-eGFPcplasmid;3.eGFPc-P7-2plasmid5.3拟南芥原生质体中的荧光定位构建获得的重组表达质粒pZero-eGFPc-P72和空载体质粒pZero-eGFPc在PEG的介导下，转入拟南芥原生质体细胞中，培养36h后在共聚焦显微镜（LeicaTCSSP5）下观察，阴性对照pZero-eGFPc的绿色荧光在细胞膜、细胞质和细胞核均匀分布，没有发现组织特异性（图15）；pZero-eGFPc-P72转染的原生质体中，可观察到绿色荧光在细胞质和细胞核中均有分布。图中红色荧光表示为叶绿体的自发荧光（图16）。图15GFP蛋白在拟南芥原生质体中表达Fig.15ExpressionofGFPproteininArabidopsisprotoplasts32 图16pZero-eGFPc-P72融合蛋白在拟南芥原生质体中表达Fig.16ExpressionofpZero-eGFPc-P72fusionproteininArabidopsisprotoplasts5.4水稻原生质体细胞中GFP基因的表达取培养的日本晴水稻悬浮细胞，同样用PEG介导的方法将含有绿色荧光GFP基因的质粒pZero-eGFPc转入水稻原生质体中，室温培养36h后在共聚焦显微镜（LeicaTCSSP5）下观察，GFP的绿色荧光在细胞质和细胞核均匀分布，无组织特异性（图17）。但是水稻原生质体的整体转化效率较低，显微镜视野中只有少数细胞有绿色荧光，并且不完整的破碎的细胞碎片较多，具有完整结构的细胞较少，与拟南芥原生质体的转化质量相比还不理想，可能是由于操作过程中的机械损伤，或是培养温度等条件不当造成的。质粒的低转化效率可能是因为拟南芥原生质体的转化体系可能并不适合水稻原生质体的转化，用PEG介导的细胞转化方法可能还需要进一步实验探索进行改进。研究中拟南芥和水稻原生质体转化的区别在于：拟南芥原生质体的获得是通过培育无菌苗，在缓冲液中将无菌苗切碎，形成细胞悬浮液，再加入纤维素酶和浸解酶去除细胞壁；而水稻是直接由愈伤组织建立起悬浮细胞培养体系，在细胞转化实验中直接取培养的细胞悬浮液进行去壁处理即可。因此，水稻细胞悬浮液中细胞的生长阶段与生理状态会直接影响到原生质体的质量，也可能是导致水稻原生质体活性细胞数量较少的原因之一。33 图17GFP蛋白在水稻原生质体中表达Fig.17ExpressionofGFPproteininriceprotoplasts34 讨论1RBSDVP7-2的基因克隆及序列分析水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病是我国主要的粮食作物病毒病害之一，严重危害水稻和玉米生产，其病原物均为RBSDV。该病毒经灰飞虱以持久性的方式进行循环传播，在田间很难进行有效的防治，并且当前还缺乏有效的抗病品种，因此采用分子生物学等技术手段了解该病毒的基因组结构及其编码的相关蛋白的功能对于病害防治显得尤为重要。目前对于RBSDV全基因组序列的测定已经完成，其10条基因组片段均为dsRNA。每条基因组片段正链都有5’-端帽子结构，3’-端均没有Poly(A)尾巴，负链5’-端都磷酸化。我们以感病水稻的浙江分离物为材料，提取了病毒的基因组，对基因组片段S7-2进行了序列扩增。通过序列比对发现，RBSDV-浙江分离物与RBSDV-河北分离物（登录号为AJ297428.1）、RBSDV-河南分离物（登录号为AY147039.1）、RBSDV-温州分离物（登录号为EU111804.1）的氨基酸序列同源性均为100%，并且与南方水稻黑条矮缩病毒P7-2的相似性也高达99%。这种来源不同的病毒分离物间的高度保守性表明该基因片段在进化过程中具有比较高的稳定性，这种高度保守的基因片段对于病毒自身的繁殖和运输以及在寄主中行使其生物学功能来说可能具有非常重要且不可替代的作用。RBSDV基因组片段S7含有大小相似的两个非重叠的ORF，两个ORF间含有52个核苷酸序列，富含AT碱基，并且不同RBSDV分离物S7的两个ORF间的核苷酸序列均具有该特征[37]，因此推测这52个核苷酸可能参与调控P7-2的基因表达，具体如何调控还有待进一步实验验证。2RBSDVP7-2的原核表达及抗血清制备RBSDV的10条dsRNA基因组可编码12个不同的蛋白，其中有6个为非结构蛋白。基因组S7编码的两个非结构蛋白中，近年来对P7-1蛋白的分子机制以及功能研究取得了一定的进展。无论是在寄主植物还是在寄主昆虫的细胞中，P7-1均可形成管状结构[22]。管状结构对病毒在介体灰飞虱内的扩繁、突破中肠瓶颈，进入血淋巴、唾液線，最终实现对病毒的传播起着重要作用。然而，目前管状结构在植物细胞内的生物学功能还有待于进一步证实。P7-2蛋白的基因序列虽早已被测定，由于P7-2位于双顺反子的第二个开发阅读框，和单顺反子mRNA的翻译效率相比，双顺反子的第二个ORF的翻译效率是极低的[38,39]。其蛋白质的表达水平相对较弱，目前还没有试验证据显示RBSDV侵染寄主后在寄主体内表达和积累P7-2蛋白。对P7-2开展研究的前提便是对P7-2进行蛋白质表达的检测，证实RBSDV在寄主体内确实存在翻35 译产物。为实现这一目的，需要制备特异、灵敏的抗血清。病毒特异性抗血清的制备有利于我们进一步通过分子生物学和生物化学的方法进行病毒蛋白的功能研究，并且制备高效的抗血清有利于田间病毒的快速诊断和检测，对于病毒的流行监测与防治具有重要的实践意义。与分离纯化病毒的方法制备抗血清相比，原核表达技术操作简单、周期短、蛋白表达量高，并且制备的抗血清具有特异性，因此本研究借助原核表达技术制备了RBSDVP7-2蛋白的抗血清。在原核表达过程中，我们在蛋白粗提物的上清中并未检测到P7-2蛋白的特异性条带，原因可能是该蛋白的表达量太低。为获得可溶性的目的蛋白，我们对P7-2蛋白进行了大量诱导表达，以提取蛋白沉淀中的包涵体。在提取包涵体时我们发现，在大量诱导表达P7-2融合蛋白时，在回收的上清溶液中检测到了与目的蛋白大小位置相符的特异性条带，可能的原因是在进行小量表达时的温度和时间并不适合该蛋白的表达。虽然我们在大量诱导表达时意外地获得了P7-2的可溶性上清，但和包涵体中提取的目的蛋白经SDS-PAGE检测对比发现，包涵体中的目的蛋白纯度较高，而上清蛋白中的杂质蛋白较多，不利于特异性抗血清的制备。因此我们对包涵体中P7-2融合蛋白进行了纯化回收，通过免疫家兔获得了P7-2蛋白的免疫抗血清，为下一步的功能研究奠定基础。3P7-2融合蛋白与寄主水稻总蛋白的互作分析本研究采用Pull-Down实验探索寄主水稻与RBSDVP7-2蛋白间可能存在的互作关系。原核大量诱导表达的病毒融合蛋白P7-2经纯化回收，与感染RBSDV的病株水稻叶片总蛋白进行Pull-Down后，通过SDS-PAGE检测，将特异的蛋白条带割胶回收并进行蛋白质序列的测定。测序后的蛋白经质谱分析，筛选得到4个蛋白。将它们的序列放在水稻基因库中进行比对，找到其相对应的蛋白分别为2个转录相关蛋白，1个类似的氨基转移酶和1个假定的分子伴侣60前体。因此，可根据这些寄主水稻中与P7-2存在直接互作关系的蛋白具有的生物学功能，来进一步分析和推测P7-2蛋白可能存在的功能。转录是蛋白质合成的前提，也是基因调节的主要阶段。在转录过程中需要多种辅助因子的参与和协助。这些蛋白因子通过特异性结合基因片段的特定序列，行使调控基因表达的功能。P7-2蛋白与寄主水稻中的2个转录相关蛋白发生潜在的直接互作，表明P7-2可能通过激活或抑制相关转录因子的表达来调控植物体内的基因表达。氨基转移酶是植物光呼吸途径中一个至关重要的酶，对光呼吸途径的正常运转以及植物体碳、氮的代谢都起着重要的作用[40]。该酶是过氧化物酶体中植物光呼吸代谢途径中的酶类，植物的光呼吸在过氧化物酶体中产生的H2O2作为抗病信号分子，能够激发植物细胞发生过敏性反应（HR），使植物产生相应的抗病反应[41,42]。由于P7-2蛋白与该寄主蛋白存在潜在的直接互作关系，说明P7-2蛋白可能是调控寄主中氨基36 转移酶表达的因子之一，从而改变寄主的生理状态，影响植物的抗病性。分子伴侣是机体内一大类蛋白质的总称，具有协助体内生物大分子的折叠、组装、跨膜运输以及调节转录和复制的作用[43]。分子伴侣可以介导蛋白质的正确装配，但本身并不成为其结构中的一部分，这与酶的特性很相似。现在已知的分子伴侣主要由热激蛋白（Heatshockprotein，HSP）的几个家族构成。分子伴侣60是HSP家族的成员，在原核与真核细胞的多种细胞器中均有分布[44,45]。P7-2蛋白与假定的分子伴侣60前体存在潜在互作关系，表明P7-2蛋白的某些生物功能或代谢途径有分子伴侣的参与。目前对于酵母和动物体内的分子伴侣研究较多[46]，而对植物体内分子伴侣调节转录和复制的机制还尚不明确，有待进一步深入研究。通过Pull-Down等蛋白质组学实验虽然已经钓出寄主水稻中与P7-2蛋白存在直接互作的因子，但病毒蛋白如何调节寄主互作因子表达还需要进一步验证，并且蛋白体外互作实验不能模拟内环境，对于寄主体内是否存在其他能与P7-2直接互作的因子，需要酵母双杂交等体内研究蛋白质互作的技术进行研究。4寄主互作因子基因表达的定量分析虽然通过Pull-Down等蛋白互作实验可以找出与RBSDVP7-2蛋白发生潜在互作的寄主水稻蛋白，但是病毒蛋白如何调控这些寄主蛋白的表达还不能确定。实时荧光定量PCR技术通过引入能与双链DNA特异性结合的化学荧光染料，在PCR反应过程中对每一个循环的扩增产物产生的荧光信号进行实时检测，从而能够对靶核酸进行准确有效的定量分析[47,48]。传统的PCR技术虽然可以对PCR扩增产物进行定性和半定量的分析，但是具有终点检测的局限性，即分析的只是最终的PCR产物，不能够保证起始模板的拷贝数与PCR终产物的信号成线性关系，无法确定起始模板的拷贝数[49]。因此与传统PCR技术相比，实时荧光定量PCR技术具有灵敏度高，高通量，特异性强，定量准确和RCR污染少等优点[47,50]。在自然界中，植物的抗病性与病原微生物的致病性保持一种动态平衡[51]。一方面，植物可通过体内系统的免疫机制来抵抗外源病毒的侵染，通过产生信号分子来启动植株防卫基因的表达[52]；另一方面，病毒在寄主细胞内可编码相应的功能蛋白来调控寄主蛋白的表达，尤其通过对关键蛋白进行改变或修饰，来改变植物的生理状态，从而降低植物的抗病性，最终使植物发病[53,54]。通过分析找出能与病毒蛋白发生直接互作的寄主蛋白，并确定该寄主蛋白在植物受到病原物侵染前后表达量发生的变化，对于了解病毒的致病机制和寄主植物相对应的生物防御机制具有十分重要的作用。在Pull-Down实验中我们钓出与RBSDVP7-2发生潜在互作的寄主蛋白，通过生物信息学分析出这些蛋白分别为转录相关蛋白，类似的氨基转移酶和假定的分子伴侣60的前体。实时荧光定量PCR分析显示，转录相关蛋白和假定的分子伴侣60前体在感病植株中的表达量与健康植株相比上调，表明RBSDV的P7-2蛋白可能具有转37 录激活活性；另一方面，类似的氨基转移酶蛋白在感病植株中的表达量与健康植株相比是下调的，这表明由于RBSDV的侵染抑制了水稻中该酶蛋白的表达和酶活性，从而抑制了植物的光呼吸途径并影响了植物体内的物质代谢，降低了水稻植株的抗性，使其致病。由于P7-2蛋白与该寄主蛋白存在潜在的直接互作关系，说明P7-2蛋白可能是抑制寄主中氨基转移酶表达的因子之一，据此推测P7-2蛋白可能是该病毒侵染寄主植物过程中十分重要的致病因子。5P7-2在植物细胞中的亚细胞定位病毒的各项生命活动都依赖于寄主细胞，无论是病毒本身的复制与繁殖，还是病毒通过编码致病因子影响寄主的生理状态，都离不开寄主细胞。病毒编码蛋白质的亚细胞定位是功能基因组学的重要部分[55]。病毒的侵染会严重影响寄主体内的基因表达。植物呼肠孤病毒侵染寄主后，寄主细胞中数以千计的基因表达会发生变化[56]。这些变化可能是由于病毒编码特定的蛋白质进入细胞核并参与寄主基因的转录调节带来的直接影响[57]。RBSDV的次要核心蛋白P8是目前为止已知唯一能进入细胞核并抑制转录的斐济病毒蛋白[58]。通过明确特定病毒蛋白在寄主细胞中的定位，有助于我们了解病毒蛋白的功能并为深入的实验研究奠定基础。对于蛋白质亚细胞定位的研究方法有多种，目前应用最广泛的方法是构建绿色荧光蛋白（GFP）的表达载体，再将目的基因连接到载体上，使目的基因蛋白与标记蛋白GFP在细胞中进行融合表达，根据检测观察细胞中的绿色荧光位置来确定目的蛋白在细胞中的定位。GFP蛋白对活细胞的生理活性无影响，并且稳定性高，荧光的产生不需要任何外源的反应底物[59]。拟南芥作为模式植物之一，近年来广泛应用于分子生物学和细胞生物学的研究领域。由于拟南芥具有植株个体小，生命力强易于栽培，生长周期短，种子量大[60,61]等优点，并且目前已汇总了4418个拟南芥蛋白质的亚细胞定位数据分析，构建了单一植物中最大的蛋白亚细胞定位数据库[62]，为相关的研究提供了重要依据。因此我们制备拟南芥的细胞原生质体作为研究基因亚细胞定位的材料。本实验通过将病毒目的基因S7-2构建到带有GFP标签的表达载体上，获得重组质粒，并制备拟南芥原生质体的细胞悬浮液，再将重组质粒转化到拟南芥原生质体中进行融合蛋白的表达，通过绿色荧光在细胞中的位置来确定目的基因蛋白在细胞中的定位。由于在制备原生质体细胞悬浮液以及细胞转化中的实验体系尚未建立，因此本研究先以模式植物拟南芥为材料，探索原生质体转化的实验方法和条件，对于细胞转化的时间和转化后目的融合蛋白在细胞中表达的时间做了多次梯度实验。通过重复实验和共聚焦显微镜观察发现，细胞转化最适时间为10~15min，而在转化完成后的24~36h通过共聚焦显微镜观察荧光表达的定位最佳。含有目的基因RBSDVS7-2的重组质粒转染的原生质体中，可观察到绿色荧光在细胞质和细胞核中均匀分布，因此可初步38 确定P7-2蛋白在拟南芥细胞中主要定位于细胞核与细胞质中。水稻作为RBSDV侵染的主要寄主之一，若能明确病毒蛋白在寄主水稻细胞中的亚细胞定位，对于病毒蛋白功能的研究和可能存在的致病机理具有积极意义。因此，我们以日本晴水稻愈伤组织为材料，建立了日本晴悬浮细胞体系，并将带有GFP基因的表达质粒转入水稻原生质体中。根据共聚焦显微镜显示，具有完整结构的活细胞数量较少，且GFP基因的转化效率很低，导致细胞碎片较多的原因可能是在实验操作过程中造成的机械损伤，或者是由于质粒转化后对于细胞原生质体培养的温度等条件不适宜造成的。而质粒的低转化效率可能是因为拟南芥原生质体的转化体系可能并不适合水稻原生质体的转化，因此该实验体系尚不能用于P7-2蛋白在水稻原生质体中的亚细胞定位研究，体系在建立初期尚不稳定，因此对实验条件和操作方法还有待进一步完善。实验中对于拟南芥和水稻细胞的获取方式也存在差异。拟南芥是通过将培育的无菌苗切碎，先制备成细胞悬浮液，再通过酶处理去除水稻细胞壁，而水稻是直接由愈伤组织建立起悬浮细胞培养体系，在细胞转化实验中直接取培养的细胞悬浮液进行去壁处理即可。我们在研究中也尝试过通过拟南芥无菌苗制备出细胞悬浮液后，用水稻细胞悬浮液的培养体系对拟南芥细胞进行恒温培养，每天通过显微镜对培养中的细胞完整性和活性数量进行观察，发现细胞死亡速度较快，表明水稻细胞的培养体系不能用于拟南芥细胞的培养。39 全文总结及展望本文以RBSDV侵染的水稻浙江分离物为材料，克隆了RBSDV基因组片段S7-2并对其进行了序列的测定。序列分析表明，不同病毒来源分离物间的P7-2高度保守，同源性高达100%，表明编码该蛋白的基因片段S7-2在进化过程中具有极高的稳定性，对病毒本身具有非常重要的作用。经DANMAN对蛋白结构的分析发现，P7-2含有11个α-螺旋，成稳定的球状结构，在靠近N端有结合小分子物质的能力。Pull-Down技术是目前研究蛋白质体外互作最常用的技术手段之一，具有易操作、周期短、假阳性低等优点。此技术也适用于利用病毒蛋白捕获直接互作的寄主因子，对了解病毒致病和植物抗病的分子机制具有重要作用。因此为进一步了解病毒编码蛋白P7-2的生物学功能，我们在大肠杆菌中对该基因编码的蛋白P7-2进行了原核表达。经纯化的融合蛋白与提取感病水稻中的总蛋白进行Pull-Down实验。经SDS-PAGE检测后，将捕获的蛋白质割胶回收后进行串联飞行质谱分析，确定捕获蛋白的部分氨基酸序列，筛选得到4个蛋白，根据它们在RiceGenomeAnnotationProject中的序列比对分析，表明其中2个蛋白为转录相关蛋白，1个蛋白为氨基转移酶蛋白，1个蛋白为假定的分子伴侣60的前体。实时荧光定量PCR的数据分析表明，4个目的蛋白在感病水稻中的表达量与健康水稻中的表达量相比，转录相关蛋白和假定的分子伴侣60的前体的表达量增加，氨基转移酶蛋白的表达量降低。据此推测RBSDVP7-2蛋白可能具有转录激活活性，并且抑制寄主中氨基转移酶的表达，从而降低了寄主植物的抗病性。由于Pull-Down为体外蛋白互作实验，并不能模拟生物体内环境，因此钓出的寄主互作因子可能并不完全。寄主水稻体内是否还存在其他与P7-2具有直接互作关系的因子，并且已钓出的寄主互作因子与病毒蛋白的互作关系也需要进一步实验对其验证，因此对于后续研究提出以下建议：1、进一步分析筛选到的4个寄主水稻互作蛋白，克隆其全长序列并将该基因亚克隆到原核表达载体中，在大肠杆菌中大量诱导表达其融合蛋白，运用Pull-Down技术手段分别验证RBSDVP7-2蛋白与寄主互作因子的直接互作关系。2、运用酵母双杂交、双分子荧光互补等体内研究蛋白质互作的实验技术，进一步验证钓出的寄主蛋白与病毒P7-2蛋白在活细胞内的互作关系，并探索是否存在其他能与P7-2蛋白发生直接互作的寄主因子。3、构建一系列突变体，借助本研究中的实验技术及研究体系，明确寄主互作因子中的功能位点。40 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附录A：常用溶液及培养基配制方法（1）LB液体培养液：10g蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，水溶解后，调节pH至7.0，加ddH2O定容到1000mL，121°C高压蒸汽灭菌20min。（2）LB固体培养基：在LB液体培养基每1000mL中加入10g琼脂，121°C高压蒸汽灭菌20min。（3）10×TAE：48.4gTris，114.2mL冰乙酸，20mL0.5M的EDTA（pH8.0），加水定容至1000mL。（4）抗生素：氨苄青霉素（Amp+）100µg/mL，卡那霉素（Kan+）50µg/mL。（5）1×BufferH：20mMTris-HCl（pH7.4），0.2MNaCl，1mMDTT，1mMEDTA。（6）4×LoadingBuffer：200mMTris-HCl（pH6.8），20%β-巯基乙醇，8%SDS，0.4%溴酚蓝，40%甘油。（7）30%丙烯酰胺溶液：290g丙烯酰胺，10gN,N’-亚甲双丙烯酰胺，用ddH2O溶解并定容到1000mL，用0.22μM滤膜过滤除菌后避光存于4°C。（8）10%过硫酸胺：称取过硫酸胺1g，加水至10mL，搅拌溶解，避光存于4°C。（9）10%SDS：100gSDS溶于900mL水中，加热至68°C溶解，加几滴浓盐酸调pH至7.2，定容至1000mL。（10）染色Buffer：0.1%溴酚蓝，100mL甲醇，14mL冰乙酸，加水定容至200mL。（11）脱色液：250mL甲醇，70mL冰乙酸，加水定容至1000mL。（12）Western电转移缓冲液：2.9g甘氨酸，5.8gTris，0.37gSDS，200mL甲醇，加水定容至1000mL。（13）TBS：20mMTris-HCl（pH7.5），500mMNaCl。（14）TBS-T：TBS，0.05%Tween20。（15）BlockingBuffer：TBS，1%BSA（sigma）。（16）AntibodyDilutionBuffer：TBS，0.2%BSA，2%PVP。（17）APBuffer：100mMTris-HCL（pH9.5），100mMNaCl，5mMMgCl2，加水定容至1000mL，灭菌后室温保存。（18）MS固体培养基：1/2×MS（pH5.7），1%Sucrose，0.7%Agar，加ddH2O定容到1000mL，121°C高压蒸汽灭菌20min，倒板时确保培养皿中固体基质的厚度至少0.5cm。（19）W5液体培养基：0.1%glucose，0.08%KCl，0.9%NaCl，1.84%CaCl2，2mMMES-KOH（pH5.7），加ddH2O定容到1000mL，121°C高压蒸汽灭菌20min后于4°C备用。（20）TVL：0.3MSorbitol，50mMCaCl2，加ddH2O定容到400mL，121°C高压蒸45 汽灭菌20min。（21）EnzymeSolution：0.5MSucrose，20mMMES-KOH（pH5.7），20mMCaCl2，40mMKCl，0.4%cellulase（7.5U/mg），0.4%Macerozyme（0.45μm），加ddH2O定容到400mL，用过滤膜进行抽真空灭菌。（22）MMG：4mMMES-KOH（pH5.7），0.4Mmannitol，15mMMgCl2，加ddH2O定容到50mL，121°C高压蒸汽灭菌20min。（23）PEG-Calcium转化溶液：40%PEG4000，0.2Mmannitol，100mMCaCl2，加ddH2O定容到50mL，121°C高压蒸汽灭菌20min。（24）种子消毒液：50%NaClO中加入1滴甘油。（25）N6培养基母液（20倍）：56.6gKNO3，2.506gCaCl2，3.70gMgSO4·7H2O，8.0gKH2PO4，9.26g(NH4)2SO4，加ddH2O定容到1000mL，121°C高压蒸汽灭菌20min。（26）B5微量母液（100倍）：0.0750gKCl，0.30gH3BO3，1.0gMnSO4·7H2O，0.2gZnSO4·7H2O，0.025gNaMoO4·2H2O，0.0025gCuSO4·5H2O，0.0025gCoCl2·5H2O，加ddH2O定容到1000mL，121°C高压蒸汽灭菌20min。（27）铁盐：27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2EDTA·2H2O。（28）2,4-D：称取2,4-D固体500mg，加入到10mL1M的NaOH中，用玻璃棒将其碾碎，接着添加约18mL的ddH2O，溶解后再定容。（29）水稻愈伤组织诱导培养基（1L）：50mLN6大量元素，1mL烟酸，10mL肌醇，0.3gCH，3.0gPhytagel，10mLB5微量，1mL盐酸吡哆醇，0.5gL-Gln，10mL2,4-D，10mL铁盐，1mL盐酸硫胺素，0.5gL-Pro，30g蔗糖，调pH至5.8。（30）水稻愈伤组织继代培养基（1L）：50mLN6大量元素，1mL烟酸，10mL肌醇，0.3gCH，30g蔗糖，10mLB5微量，1mL盐酸吡哆醇，0.5gL-Gln，0.5mL2,4-D，3.0gPhytagel，10mL铁盐，1mL盐酸硫胺素，0.5gL-Pro，0.5mLNAA，调pH至5.8。46 致谢岁月如梭，如歌。三年硕士求学生活随着学位论文的完成行将结束，我想在以后的岁月中我将永远铭记这充实紧张而又收获颇丰的三年。三年前陈剑平院士给予我来浙江省农业科学院学习的机会，使我有幸忝列弟子之中。陈老师平易近人的长者之风、渊博的学识、敏锐的思维、精益求精的工作作风和严格务实的生活态度，使我终生受益。本论文从选题、设计、实验到撰写完成，无不浸透着导师的心血与智慧。在此，我向我的导师陈剑平院士表示深切的谢意与祝福！本论文的全部工作在浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所完成。衷心感谢孙丽英副研究员在论文从选题、设计、实验到撰写完成过程中所给予的指导和帮助。孙老师严谨实在的治学态度，勤奋积极的工作精神，宽厚待人的处事理念，使我不仅学会了如何学习，更懂得了今后在工作和生活中如何更好地与人相处。感谢课题组Andika副研究员、王旭老师、谢礼博士、孙宗涛博士和李俊敏博士对实验技术的指导。感谢程烨老师、王琴阿姨在实验和生活上的关心与帮助。感谢实验室各位同学在学习和日常生活上的帮助。感谢安徽农业大学植物保护学院檀根甲教授、高智谋教授、丁克坚教授、吴慧平副教授、江彤副教授、徐伟老师和徐丽老师给予我的关心和帮助。感谢李翔宇、邓竹根、杨有志、谢朝阳、张胜和宋伟等同学的帮助与支持。此外，我要特别感谢我的父母对我的教导和培养，是他们的理解和企盼给予我奋力进取的勇气和动力；同时感谢亲友们所给予的鼓励和精神上的支持。最后，向在论文审阅、评议与答辩过程中给予指导的各位专家表示衷心的感谢和美好的祝愿！谨以此文，感谢这三年来所有帮助我的人们，祝他们健康幸福！张上林2013年4月于杭州47 作者简介张上林，男，汉族，1988年9月出生，天津人，中共党员。2010年毕业于安徽农业大学植物保护学院动植物检疫系，获理学学士学位。同年9月考入安徽农业大学植物保护学院，攻读植物病理学硕士学位，师从陈剑平院士。硕士期间主要从事水稻黑条矮缩病毒基因功能研究。在读期间发表的学术论文：1）张上林,孙丽英,陈剑平*.四种水稻蛋白与水稻黑条矮缩病毒编码非结构蛋白P7-2的互作分析.浙江农业学报（已接受）2）ZongtaoSun,ShanglinZhang,LiXie,etal.ThesecretorypathwayandtheactomyosinmotilitysystemarerequiredforplasmodesmatallocalizationoftheP7-1ofriceblack-streakeddwarfvirus.ArchivesofVirology,2013,158(5):1055~106448