布鲁氏菌部分体内感染因子免疫保护的研究

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1、摘要布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌（Brucella）引起的慢性传染病，是目前世界上流行最广、危害最大的人畜共患病之一，在我国被列为法定二类传染病。布鲁氏菌病严重威胁着人、畜健康。减毒活疫苗是当前应用最广泛的布鲁氏菌疫苗，有较好的免疫保护力，但存在诸如毒力易返强等安全问题。灭活疫苗只能提供短暂的保护力。相比之下，亚单位疫苗组分明确，有疫苗的生产容易控制，且副作用小的优点，故具有广阔的前景。布鲁氏菌毒力因子和胞内寄生机制的研究已成为国内外学者研究的重点。研究表明，布鲁氏菌基因组中许多基因与布鲁氏菌生长、侵袭、寄生和免疫等功能密切相关，但仍

2、有约22%的编码基因功能不明。实验室的前期研究中，使用体内诱生抗原技术（invivo-inducedantigentechnology，IVIAT）筛选到33个体内感染因子，对其中部分体内感染因子进行免疫保护的研究，旨在为防控布鲁氏菌病筛选到更多的保护性抗原。首先，选取IVIAT筛选到的体内感染基因YaeC、Asly、EcoA、MDH、SDR、Fumhy、nitrite、EnvZ、GntR、Arg和Sugar11个，在大肠杆菌中表达、纯化。分别扩增11个编码布鲁氏菌体内感染基因片段,克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组表达质粒,并转化大肠杆菌B

3、L21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导表达的各重组蛋白，经亲和层析法进行纯化。以MDH蛋白作为阳性对照，对其余10种重组蛋白与纤连蛋白和纤连蛋白溶酶原的结合活性进行检测，同时使用已知的没有结合活性的BSA作为阴性对照。结果表明，在11个重组蛋白与纤连蛋白和纤连蛋白溶酶原的结合活性检测，筛选到的Asly、EcoA、MDH、SDR、Fumhy、nitrite、EnvZ、Arg、Sugar9个蛋白都能与纤连蛋白及纤连蛋白溶酶原结合，推测这些蛋白可能在布鲁氏菌黏附和侵入宿主细胞的过程中发挥一定的作用，可能参与布鲁氏菌的致病性及其在宿主细胞内的存活与增殖。其次

4、，利用获得的重组蛋白免疫小鼠，对免疫小鼠的体液免疫指标和细胞免疫指标分别进行检测，以便对重组蛋白的免疫保护性进行分析。具体是将蛋白以佐剂乳化后免疫小鼠，在免疫后不同时间分别开展对小鼠的抗体效价的测定、外周血淋巴细胞亚型的鉴定，外周血中细胞因子含量的测定。结果，抗体检测在二次免疫后各免疫组均能产生较高水平的特异性抗体。对攻毒后的免疫小鼠血清中细胞因子检测结果表明，攻毒后Asly、nitrite和sugar蛋白免疫组血清中IFN-γ的含量极显著的高于对照组（p＜0.01），而IFN-γ主要是由免疫系统中的T细胞和NK细胞产生以清除宿主细胞内的病原，从而保护宿

5、主免受布鲁氏菌的感染。IL17A含量也有显著高于对照组（p＜0.05），IL17A含量的上升显示I出Th17细胞的活化，而Th17细胞的活化能有效的介导组织的炎症反应，从而加速机体对布鲁氏菌的清除与杀灭，保护机体免受感染。最后，对免疫后的小鼠，用感染B.abortus2308攻毒后10天，进行小鼠脾脏内细菌数计数，评价各重组蛋白对免疫小鼠脾脏载菌量的影响。结果表明，Asly、nitrite和sugar可以保护小鼠抵抗布鲁氏菌的感染，具有较好的免疫保护效果，免疫组小鼠脾脏载菌量和对照组小鼠有显著的差别，Asly免疫组小鼠脾脏的载菌量比对照组减少2倍多，ni

6、trite免疫组减少7倍，而sugar免疫组更是减少了14倍；流式细胞术检测结果表明，Asly和sugar免疫组的CD4+/CD8+比值要显著低于对照组，而nitrite免疫组的CD4+/CD8+比值要显著高于对照组，表明Asly和sugar重组蛋白可以诱导特异性的CD8+淋巴细胞应答，而nitrite则是CD4+淋巴细胞应答。综上所述，研究筛选出了3个对小鼠抵抗B.abortus2308感染具有保护力的抗原，并对保护性抗原免疫后的体液免疫和细胞免疫指标进行了研究，所得到的结果为研究预防布鲁氏菌病的疫苗提供参考。关键词:布鲁氏菌,体内感染因子,保护性抗原

7、,体液免疫,细胞免疫IIAbstractBrucellosisisachronicinfectiousdiseasecausedbyBrucella.Itistheworld'smostpopularwidedisease.AsoneofthemostdamagingzoonoticdiseasesofstatutoryBinfectiousdiseases,ithasseriouslythreatedtohumanandanimalshealth.TheliveattenuatedvaccineisthemostwidelyusedforBrucell

8、acurrently,whichcanprovidebetterprotecti