tp53、kras和egfr基因在非小细胞肺癌顺铂辅助化疗中肿瘤标记物的研究

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1、山东师范大学博士论文目的TP53、KRAS并口EGFR基因突变在JIl页铂辅助化疗术后非小细胞肺癌中肿瘤标记物作用的研究中文摘要肺癌是一种常见的肺部恶性肿瘤，其死亡率已占癌症死亡率之首。其中非小细胞肺癌(Non—smallcell1ungcancer，NSCLC)占肺癌85％。早期NSCLC患者一般手术切除，但30％一60％的患者仍会复发并可能死亡。临床研究已验证，顺铂(cisplatin)辅助化疗可以提高术后NSCLC的生存期。对NSCLC患者术后行辅助化疗目前己成为标准，但总生存率仅能提高4．1％左右，可见多数患者并未得益于术后化疗。筛选出可能从中获

2、益者以使多数未获益者免受化疗带来的副作用，这将是当今肺癌研究的热点。随着分子生物技术的发展，肿瘤研究已进入分子水平时代。现阶段对于肿瘤的基础及临床研究分为分子机制、分子诊断、分子预后等几个方面。沿用至今的恶性肿瘤TNM分期在预后的估计上已证明有巨大的价值，同时也深刻地影响着癌症治疗决策，但TNM分期本身并不能从分子层次预测和揭示抗癌治疗的效果。因此迫切需要应用分子诊断技术，对肿瘤发生发展的病理学机制及生物学行为从分子水平上加以认识，在解决肿瘤异质性、分期的合理性、治疗方案的设计和预后估计的准确性上能提供更好的帮助。当前，由于一系列新技术的开发及应用(如基

3、因芯片、组织芯片及蛋白芯片等)，发现了许多肺癌新的分子标记或分子标记组合方式，可在TNM分期基础上，把分子生物学的最新研究成果结合到TNM分期中，为NSCLC的预后和治疗决策提供更有利的证据。因此，肿瘤的分子预后研究愈加受到临床的重视。一般认为，顺铂药物的毒性来自于cisplatin与DNA的结合。Cisplatin—DNA共价复合物影响细胞的基本过程，包括DNA修复、细胞周期阻滞及细胞凋亡。参与这些过程的基因突变是肿瘤发生关键因素，其中，TP53、KRAS和EGFR基因突变是肺癌中最常见的突变。TP53突变至少在50％的II—III期肺癌患者中发生，多

4、数突变为错义突变；KRAS密码子12和13的突变在肺腺癌中的突变率为20％一25％，在其它NSCLC中突变率较低；EGFR在40％一80％的NSCLC中过表达，尤其在非吸烟女性肺腺癌中高发。本文，我们系统探讨了国际肺癌研l山东p币范大学博士论文究组(IALT)体系中，TP53、KRAS和EGFR基因突变是否可以做为NSCLC顺铂辅助化疗的分子标记物，以筛选受益于顺铂辅助化疗的NSCLC患者。方法样本783例样本为国际辅助肺癌研究组(InternationalAdjuvantLungCancerTrial，IALT)的石蜡包埋组织，来自于14国家的28个中

5、心。所设计标本己获伦理委员会使用许可，并按wH02004年分类标准进行分类。TP53基因突变检测及分析QIAgenDNA提取试剂盒提取783例石蜡包埋切片的基因组DNA。TP53外显子5至8经PCR扩增后，变性高压液相质谱仪(DHPLC)和测序法检测TP53外显子5至8的突变。初筛结果为阳性的标本，二次PCR扩增及测序以确定TP53突变结果。TP53突变密码子的分布及碱基变化特点与IARCTP53数据库已知数据进行比较分析。KRAS基因突变检测及分析PCR扩增KRAS外显子l(含密码子12和13)，产物经测序筛查KRAS突变。初筛结果为阳性的标本，二次P

6、CR扩增及测序以确定KRAS的突变。KRAS的突变特点与COSMIC数据库相关资料进行对比分析。EGFR基因突变检测及分析直接测序法筛查EGFR基因外显子18至21存在的突变。初筛结果为阳性的标本，二次PCR扩增及测序以确定EGFR的突变。EGFR的突变特点与COSMIC数据库相关资料进行对比。统计学分析Kaplan一_Meier法计算生存率，Log—Rank检验比较生存差别，利用多因素Cox回归模型分析分析TP53，KRAS和EGFR基因突变与其它因素的相关性，以确定TP53，KRAS和EGFR基因突变的预后和预测价值。运用SAS软件，版本8．2。争士

7、甲：日7卜1．TP53突变实验结果TP53突变率为46％(240／524)，其密码子突变热点分布与IARCTP53数据报道的基本一致。IALT数据中，碱基变化和功能变化分布特点与以往报道中NSCLC的突变特点相一致。其中，G>T碱基变换(29．97％)为典型的吸烟患者的印迹突变。TP53基因突变与NSCLC临床病理特征相关性分析表明，TP53突变与年龄、性别、TNM分期和切片的质量具有相关性。五年生存期的分析资料显示，TP53突变对NSCLC整体无预后和预测意义。但是，存Ⅱ山东师范大学博士论文在一种趋势：顺铂辅助化疗有利于TP53野生型患者的生存，而有害

8、于TP53突变型患者的生存(卢0．18总生存期和卢0．13无病生存期)。在5年生