人源pi3kc3复合物结构及其膜结合特征的研究

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1、人源PI3KC3复合物结构及其膜结合特征的研究(申请清华大学理学博士学位论文)培养单位：生命科学学院学科：生物学研究生：马梅生指导教师：俞立教授二○一七年五月StructureandmembranebindingstudyofhumanPI3KC3complexesDissertationSubmittedtoTsinghuaUniversityinpartialfulfillmentoftherequirementforthedegreeofDoctorofPhilosophyinBiologybyMaMeishengDissertationS

2、upervisor:ProfessorYuLiMay,2017摘要摘要细胞自噬是一种从酵母到哺乳动物细胞都很保守的受多种条件诱导的真核降解途径。根据自噬的发生发展过程，它主要分为起始，延伸和融合三个阶段。在哺乳动物细胞内，当细胞处于饥饿等胁迫条件下，通过信号转导，从内质网上一个富含磷脂酰肌醇3磷酸（PI3P）的区域-欧米茄体（Omegasome）起始自噬的发生。然后通过多种自噬蛋白的协同作用形成成熟的自噬小体最后与溶酶体融合成为自噬溶酶体。在细胞自噬的起始过程中，Ⅲ类磷脂酰肌醇激酶复合物（PI3KC3）扮演着极其关键角色。人源PI3KC3复合物包

3、括C1和C2复合物，其中C1复合物是细胞自噬必需蛋白机器，而C2复合物在自噬中的作用尚有争议。本研究通过冷冻电镜技术解析了人源PI3KC3-C1和C2复合物的亚纳米分辨率三维结构。结构比较分析表明C1与C2复合物整体都呈现相同的“L”构象，但具有明显不同的特征。VPS34的激酶结构域在C1复合物中非常柔,而在C2复合物中却比较刚性,这可能是导致它们激酶活性差异的原因之一。此外，C1中Beclin1-ATG14L螺旋束相对C2中Beclin1-UVRAG螺旋束的位置呈25°C上移，导致后者与主体部分的结合表面更大。结合电镜及生化实验表明PI3KC3

4、-C1在单层脂膜上呈现“站立”构象，其中ATG14LC末端的BATs结构域负责将复合物锚定在膜上，而VPS34的激酶结构域决定复合物在膜上的取向。脂质体-蛋白结合实验显示C1复合物能结合PI和PI3P，且其结合能力显著比C2复合物强。值得注意的是C2复合物对PI结合能力极差，大约只有C1复合物的10%-30%，这种结合能力的差异主要由ATG14LBATs所决定。纯化的内质网与复合物蛋白的结合特点与脂质体实验结果相似，提示C1与C2复合物对PI结合能力的差异可能造成两者在细胞自噬起始过程发挥不同作用。此外，我们发现C1复合物能在体外与磷脂形成clu

5、ster,而C2复合物不能。实验表明这种cluster的形成依赖于VPS34激酶活性和复合物的膜结合活性。综上所述，我们通过冷冻电镜结构和生化分析揭示了人源PI3KC3-C1和C2复合物功能差异的分子机制，同时为揭示欧米茄体的生物发生提供了有力线索，从而对细胞自噬起始过程的分子机制有了更一步的理解和认识。关键词：PI3KC3；BATs；磷脂酰肌醇；膜结合；细胞自噬；冷冻电镜ⅠAbstractAbstractAutophagyisaneukaryoticdegradationpathwaywhichisconservedfromyeasttomam

6、malsandinducedbyalotofconditions.Theautophagicprocesscanbedividedintothreestagesincludinginitiation,elongationandfusion.Understressconditionssuchasstarvationinmammaliancells,autophagyisinitiatedfromaPI3PenricheddomainonERcalledomegasomebysignaltransduction.Thenbycoordinationo

7、fseriesofATGs,thematureautophagsomeisformedandfinallyfusedwithlysosometoautolysosome.ItiswellknownthatthePI3KC3playsakeyroleintheinitiationofautophagy.TherearetwohumanPI3KC3complexesincludingC1andC2,ofwhichC1complexisessentialforautophagy,whilethefunctionofC2complexonautophag

8、yisstillacontroversy.Inthisstudy,wedeterminedtheCryo-EMstructuresofh