基于单分子定位的超分辨显微中荧光激发密度的优化

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1、生物物理学报2014年8月第30卷第5期：380-390www．cjb．org．cnACTABIOPHYSICASINICAVo1．30No．5Aug．2014：380—390基于单分子定位的超分辨显微中荧光激发密度的优化杨光1,2,3，熊大曦，梁永，李辉1．中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，江苏省医用光学重点实验室，江苏苏州2151632．中国科学院长春光学精密机械与物理研究所，长春130033；3．中国科学院大学，北京100039收稿日期：2014—04．15；接受日期：2014—08—20基金项目：国家自

2、然科学基金项目(51376191)通讯作者：李辉，电话：f0512)69588039，E—mail．"hui．1i@sibet．ac．crl摘要：基于单分子定位的超分辨显微技术中，荧光点的中心位置可通过对每个荧光点进行单点扩散函数(pointspreadfunction，PSF)逐个拟合定位或对多个荧光点进行多PSF同时拟合定位获得。定位误差以及图像采样时间与荧光激发密度直接相关。为定量得到基于这两种算法的最优荧光激发密度，模拟了成像与定位过程，比较了常见的几种荧光分子在采用基于单PSF逐个拟合和多PSF同时拟合两

3、种算法定位时的中心定位误差、荧光获取比率、获取的有效荧光点数与荧光激发密度间的关系。进而得到了采用这两种算法对不同荧光染剂进行超分辨成像时的最优荧光激发密度。该结果对单分子成像过程中荧光激发密度的选择和激发激光的强度控制具有指导意义。关键词：显微；荧光；单分子定位；激发密度中图分类号：Q．334DoI：10．3724／SP．J．1260．2014．40049引言荧光显微镜在生物医学领域有着广泛的应用。但是，包括共聚焦显微镜在内的传统光学显微镜受到阿贝光学衍射极限的限制『1_，其分辨率只能达到200nlTl以上。近年

4、来发展的基于单分子定位的超分辨荧光显微技术突破了衍射极限，可以达到20nnl的横向分辨率，因此成为生物医学显微成像领域的一个研究热点『21。根据所用荧光染剂的不同，基于单分子定位的超分辨显微技术主要有采用有机荧光分子的随机光学重建显微术(stochasticopticalreconstructionmicroscopy，STORM)t、采用荧光蛋白的光激活定位显微术fphotoactivatedlocalizationmicroscopy，PALM[41和FPALM[5]1，以及采用量子点的闪烁超分辨显微术fbli

5、nkingsuperresolutionmicroscopy)t~等。它们的基本原理都是在成像时使大多数荧光分子处于不发光的暗态，而只有少数荧光分子被随机激发，用点扩散函数对每个发光分子的光强分布进行拟合得到其中心位置；重复得到很多帧图像，进行同样的处理，标记出几乎所杨光等：基于单分子定位的超分辨显微中荧光激发密度的优化有荧光分子的位置，从而构建出最终的高分辨图像。因此，可通称为单分子定位超分辨显微术(singlemarkerlocalizationsuper．resolutionmicroscopy)。单分子定位

6、超分辨显微术已经被广泛用于研究细胞线粒体与骨架结构、网格蛋白Clathrin介导的细胞内吞过程罔，以及神经突触结构[9】等生物医学基础问题．2011年，Jones等人[10J用高亮度的Alexa647有机荧光分子修饰，实现了1S时间分辨率、20nm横向分辨率、50am轴向分辨率的三维活细胞成像，超分辨的图像结构显示网格蛋白Clathrin包围在50nln的转铁蛋白Transferrin周围，形成100~200nm的半球壳结构。Xu等人[11】通过具有更高分辨能力的双物镜STORM系统成功分辨出了神经轴突的骨架结构，

7、发现肌动蛋白Actin形成周期性的环形结构，而树突中的肌动蛋白形成贯穿的长纤维结构。黄波等人[7】在对全细胞进行STROM成像时，发现线粒体拥有球状和管状两种类型，并测出这两种线粒体的尺寸范围。该组还通过3DSTORM方法分辨出了猴子肾脏BS．C．1细胞线粒体外膜的中空结构，并观察了线粒体与细胞微管的相互作用，对细胞生物学的研究具有重要意义。哈佛大学的xu[1l】通过具有更高分辨能力的双物镜STORM系统成功分辨出了细胞的肌动蛋白纤维结构，并发现纤维骨架结构由两组垂直分开的蛋白层构成，对研究细胞移动机理提供了数据支

8、持。虽然单分子定位超分辨显微术已经在生物医学的研究中发挥了巨大作用，但是，其单分子定位精度对图像分辨率及图像质量的影响仍然有待进一步研究【l2j。荧光分子的量子效率、荧光分子修饰密度、图像背景噪声、样品漂移等，都会影响单分子定位的精度以致最终图像的质量，人们对此已经进行了深入的研究『l3】。而荧光激发密度对单分子定位精度和成像过程的影响还鲜见报道。在单分子定