含甲氧基黄酮类化合物ugt代谢特征及其机理研究

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1、摘要黄酮类化合物(Flavonoids)是一类多酚类物质，广泛存在于自然界的豆类、谷类、水果、蔬菜及许多药用植物中。大量研究报道表明黄酮类化合物可以清除自由基，具有抗氧化、抗炎、保护心血管等多种生物活性、药理作用，其抗肿瘤作用更是受到广泛关注。但是，黄酮类化合物口服生物利用度低，阻碍了具有实用价值的化学预防治疗制剂研发。因而，如果想把该类化合物研发为疾病预防治疗制剂，寻找提高其生物利用度的有效途径是关键需解决的问题。黄酮类化合物在体内的代谢情况复杂，广泛存在的葡萄糖醛酸化代谢、硫酸化代谢，是导致其生物利用度低的重要原因；其中，经尿苷二磷酸葡萄糖苷酸转移酶(U

2、DP．Glucuronosyltransferases，UGTs)催化的葡萄糖醛酸化反应是主要的代谢途径。以往研究表明，黄酮类化合物的葡萄糖醛酸化代谢具有一定的底物特异性，该代谢受到其复杂化学结构变化如甲氧基、羟基变化影响，其中羟基变化对于黄酮类化合物葡萄糖醛酸化代谢的影响研究较多；此外，最近发现含甲氧基黄酮所具有的化学预防能力往往优于非甲氧基黄酮类化合物。因此，本论文重点研究含甲氧基黄酮类化合物的葡萄糖醛酸化代谢特征及机理。为了研究含甲氧基黄酮类化合物的葡萄糖醛酸化代谢规律，选定了两个单甲氧基5,7．二羟基黄酮化合物：汉黄芩素(Wogonin)和千层纸黄素

3、(OroxylinA)，以及三个含甲氧基5．单羟基黄酮化合物：杨芽黄素(Tectochrysin，5．hydroxy一7-methoxyflavone，5H7MF)、5．羟基．7，8一二甲氧基黄酮(5．hydroxy．7，8．dimethoxyflavone，5H7，8MF)、5．羟基．6，7，8，4’．四甲氧基黄酮(5一hydroxy．6,7，8，4’一中文摘要tetramethoxyflavone，5H6，7，8，4’MF)做为模型化合物。其中，前两个化合物含两个酚羟基，结构中甲氧基位置有微小变化；而后三个化合物含单个酚羟基，A环上所含甲氧基数量依次递增

4、。拟用12种商品化人源重组UGT酶以及人体肝、肠微粒体，在体外对这五个化合物进行系统葡萄糖醛酸化代谢研究，寻找出其代谢规律、代谢特征，并拟达到以下目的：1、对这些化合物进行葡萄糖醛酸化代谢特征研究，得到其UGT酶特异性代谢指纹图谱(UGT．isoformspecificmetabolicfingerprint，GSMF)。2、分析UGT酶代谢行为特征，寻找其与人体主要代谢器官肝、肠的葡萄糖醛酸化代谢情况之间的相关性，并运用UGT酶催化的葡萄糖醛酸化代谢特征对肝、肠特异性葡萄糖醛酸化代谢情况进行预测。3、分析化学结构变化如甲氧基位置、数量变化，对模型化合物UG

5、T酶特异性代谢特征的影响。主要研究方法如下：一、人肝、肠微粒体和人源UGT酶的酶活性实验为了得到各模型黄酮化合物的GSMF，重要UGT的特异性代谢动力学情况及器官特异性葡萄糖醛酸化代谢情况，在体外运用器官微粒体和UGT酶测定酶活性。酶孵育实验步骤如下：(1)混合微粒体或UGT酶(反应最佳终浓度范围是0．0053～0．053毫克蛋白每毫升)、氯化镁0．88mM、葡糖二酸单内酯4．4mM、丙甲菌素0．022mg／ml；含有不同浓度底物的50mM磷酸氢二钾溶液(pH7．4)；以及UDPGA(3．5mM)。(2)将混合后终体积为680pl的混合物平均分以得三等份，每

6、份200I．tl，置于370C按预设时间(10至60min)同时孵育。(3)加入内含90“M苯乙酮的94％乙腈6％醋酸溶液(作内标，其中汉黄芩素、千层纸黄素、5H6，7，8，4’MF用苯乙酮，而5H7MF、5H7，8MF换为苯丙酮)终止反应。终止反应后的混合液于13，000rpm离一t∑,15分钟，取上清液进行UPLC分析。测定GSMF时，仅采用了高、中、低三个底物浓度2．5，10以及35laM。描绘UGT代谢动力学情况时，如UGT1A1，1A3，1A7．1A10对汉黄芩素、千层纸黄素代谢情况，采用了1．25．35“M(O．5．35洲)范围内9．11个底物浓

7、度。ll博士学位论文二、UPLC分析方法为了对各模型化合物及代谢产物进行分析定量，采用了以下UPLC方法：对于汉黄芩素、千层纸黄素及其相应葡萄糖醛酸化代谢物，分析系统为WatersAcquityUPLC，采用光二极管阵列检测器(DAD)及Empower软件。分离柱为BEHC18，1．7gm，2．1×50illnl。流动相B为100％乙腈，流动相A为0．1％(v／V)甲酸水溶液(pH2．5)。流速为0．4ml／min，采用梯度洗脱，o~1．5分钟时，流动相B占30．40％：1．5~2．5分钟时，流动相B占40．70％；2．5～3．0分钟时，流动相B占70．30

8、％。检测波长280nlll，注入样品体积10¨l。对