肠道病毒71型p1蛋白鼠源性单克隆抗体的鉴定及肠道病毒71型快速vp1--elisa中和实验的建立

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1、南方医科大学2011级硕士学位论文肠道病毒71型P1蛋白鼠源性单克隆抗体的鉴定及肠道病毒71型快速VPl．ELISA中和实验的建立IdentificationofapanelofMurineMonocionalAntibodiesagainstP1ProteinofEnterovirus71&DevelopmentofaVPl一ELISAAssayforRapidDetectionofNeutralizingAntibodiesagainstEnterovirus71课题来源：国家自然基金青年项目“

2、肠道病毒EV71及CoxAl6P1蛋白免疫原性及抗原表位分析”(编号：8102287)学位申请人唐培导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院答辩委主席答辩委成员吴玉章车小燕临床检验诊断学专业型硕士研究生第二临床医学院曾其毅富宁江丽芳裘宇容温旺荣2014年5月23日广州硕士学位论文肠道病毒71型P1蛋白鼠源性单克隆抗体的鉴定及肠道病毒71型快速VPl一ELISA中和实验的建立硕士研究生：唐培指导教师：吴玉章教授车小燕研究员摘要手足口病(hand，foot，andmouthdisease，HFMD)是一

3、种以发热及手、足、口腔等部位出现疱疹为主要的临床特征的儿童常见传染病。绝大部分儿童感染后的病情较轻，但少部分患儿会出现比较严重的神经、呼吸和循环系统的并发症，甚至死亡。近几十年在亚太地区频繁暴发高致病性和高死亡率的手足口病疫情，已成为严重威胁儿童健康的一种疾病。研究表明近几十年引起手足口病疫情的主要病原是肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)及柯萨奇A16病毒(CoxsachievirusA16，CoxAl6)，由于EV71具有中枢神经亲嗜性，部分EV71感染患者会出现神经系统并发症

4、(无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿等)以及全身性并发症(多器官衰竭、休克、DIC等)，是手足口病的主要致死原因，因而EV71成为科学家研究的热点。EV71属小核糖核酸病毒科，病毒由四种衣壳蛋白(VPl—VP4)组成的衣壳包裹RNA核心所构成。VPl、VP2和VP3衣壳蛋白位于病毒衣壳的外表面，因而病毒的中和表位主要位于这三个蛋白上。VP4蛋白位于病毒表面内侧，可能与维持病毒结构有关，尚无中和表位发现。由于VPl和VP4基因相对保守，目前按VPl和(或)VP4基因对EV71病毒进行分型，分A、B

5、1一B5、C1．C5，共11个基因亚型，中国大陆自1997年后只有C4亚型流行。目前针对肠道病毒EV71感染尚无有效的预防治疗药物，因而寻求预防和治T摘要疗EV71感染的药物和研制EV71疫苗正成为国内外学者共同关注的课题。临床研究表明给予患者输注免疫球蛋白可以改善病情。但是输注免疫球蛋白存在感染血液传染病的风险，并且商品化的免疫球蛋白很难保障批次间质量的一致性。使用高中和活性的单抗可以避免这些问题。因而制备高中和活性的EV71单抗可以为EV71治疗提供新的思路。由于EV71感染所致的重症手足口病会

6、留下后遗症，所以开发EV71疫苗是目前控制EV71疫情，减少疾病死亡率、致残率的最佳策略。诱导中和抗体的产生的能力是评价疫苗的效果的重要指标。目前在EV71研究中公认的中和实验方法是基于细胞病变的中和实验(cytopathiceffectbasedmicroneutralizationtest，CPE．MNT)，这种方法存在耗时耗力，结果不够客观等缺陷，不适合用于大批量检测。因而亟需建立简便、快速、客观的适合高通量检测的新方法。前期我们实验室以EV71病毒(C4亚型)和重组VP4蛋白为抗原免疫小鼠，

7、通过杂交瘤细胞法制备了一批针对EV71的抗体。为进一步明确这些单抗所针对的靶标，采用酵母展示技术构建了分别表达VPl、VP2、VP3和VP4蛋白的重组酵母，鉴定出一组针对EV71衣壳蛋白的单抗；利用经典中和实验筛选出具有中和活性的EV71单克隆抗体；另外我们建立了一种基于ELISA检测的简便、快速、客观的高通量的EV71中和实验方法。进而为研究Ev71病毒衣壳的抗原结构及功能以及疫苗制备提供实验依据。研究内容包含三个部分：第一部分：百荸母展示技术表达EV71的四种衣壳蛋白酵母表面展示技术以其较为完善

8、的蛋白质翻译后修饰和分泌机制、安全无毒等独特的优越性，近年来颇受关注，已成为蛋白质工程研究的功能平台。本研究应用pYDlEBYl00酵母展示系统将EV71的VPl、VP2、VP3和VP4四种衣壳蛋白展示在EBYl00酿酒酵母表面：根据EV71(GZR)基因序列信息设计引物，经PCR扩增获得VPl、VP2、VP3和VP4基因片段，利用双酶切和连接将目的片段定向插入到pYDl质粒中，构建了重组的VPl—pYDl、VP2．pYDl、II硕士学位论文VP3．pYDl和VP4．