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1、中国科学:化学2011年第41卷第8期:1312~1318《中国科学》杂志社SCIENTIASINICAChimicawww.scichina.comchem.scichina.comSCIENCECHINAPRESS论文基于核酸适体的丙肝病毒核心蛋白检测新方法①①①②②②①*张振,赵子龙,徐丽,吴新姣,朱海珍,谭蔚泓,方晓红①中国科学院化学研究所分子纳米结构与纳米技术重点实验室,北京100190②湖南大学生物学院分子医学系,长沙410082*通讯作者,E-mail:xfang@iccas.ac.cn收稿日期:2011-04-01;接受日期:2011-04-11doi:10.
2、1360/032011-198摘要丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)引起的一种传染性疾病.关键词发展对HCV抗原具有高亲和力高特异性的识别分子和检测方法对丙肝进行早期诊断具有非丙肝核心蛋白常重要的意义.我们通过SELEX筛选得到了能特异性识别HCV核心蛋白(core蛋白)的DNA核酸适体核酸适体,建立了可对HCVcore蛋白进行高灵敏检测的核酸适体-酶联免疫新方法,并成功SELEX应用于丙肝病人血清中HCVcore蛋白的检测,有望发展成为简便、灵敏、低成本的HCV早酶联免疫法期诊断和血清筛查新方法.1引言的检测方法一样,HCVcore蛋白
3、检测可采用基于抗[4,5]原抗体识别的酶联免疫法(ELISA)法,该方法采丙型病毒性肝炎是严重危害人类健康的流行性用两种单克隆抗体分别捕获和检测HCVcore蛋白,血液传染病,目前尚未开发出有效的HCV疫苗,发需要进行大量单抗的制备.然而单克隆抗体的制备[1]展HCV早期检测方法具有非常重要的意义.临床过程复杂,价格昂贵,保存条件苛刻.这使得检测上丙型病毒性肝炎的血清学诊断方法主要包括抗HCVcore蛋白的成本较高,检测灵敏度也受到影响.[2]HCV抗体和HCVRNA的检测.抗HCV抗体一般被称为化学抗体的核酸适体是近年来兴起的一出现在感染HCV12周后,并且有相当一部分病人
4、体种新型蛋白质分子探针[6~8].核酸适体是通过指数富内无抗HCV抗体.HCVRNA多出现于病毒感染1周集配体系统进化技术(SystematicEvolutionofLigands后,但临床检测易出现假阳性和假阴性结果.因此目byExponentialenrichment,SELEX)从人工合成的前已有的诊断方法或多或少存在窗口期检测效果不DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合理想,操作复杂,仪器昂贵,大批量筛查能力不足等蛋白质等靶标分子的单链DNA或RNA.核酸适体具局限性,离HCVcore蛋白早期诊断与临床血液或血有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力,同时制品
5、筛查的要求还有相当差距.与抗体相比具有分子量小,易合成,批量生产重复性已知HCV基因组编码约3100个氨基酸的多聚好,不易失活,便于化学修饰等优势.已有文献报道蛋白,该蛋白在机体与病毒蛋白酶作用下可分解为3了将核酸适体代替抗体引入到ELISA方法,用于检[9][10]种结构蛋白core,E1,E2及7种非结构蛋白p7,NS2,测内皮生长因子(VEGF)、凝血酶、肿瘤标志物[3][11]NS3,NS4A,NS4B,NS5A,NS5B.由于core蛋白在MUC1等蛋白,然而核酸适体用于传染病相关蛋白[12]HCV感染一周后就会出现在血液中,因此检测HCV的检测,尤其是丙肝相关蛋白
6、检测还少见报道.core蛋白有望实现HCV窗口期检测.同大多数蛋白目前将特异结合丙肝相关蛋白的核酸适体用于中国科学:化学2011年第41卷第8期[13~16]丙肝的治疗日益受到人们的重视,发展基于核96孔板)从湖南景达制药有限公司获得.链霉亲和素酸适体的丙肝相关蛋白检测新方法将在丙肝诊断治修饰的96孔板购于美国Pierce公司.[12]TM疗中具有重要的应用前景.2007年,Lee等人报道实验中使用的仪器主要包括iCycleriQ荧光实针对HCVcore蛋白筛选得到RNA核酸适体,他们采时多波长PCR检测系统(美国Bio-rad公司),共聚焦用sol-gel打印技术将RNA核
7、酸适体固定到96孔板荧光显微镜(日本Olympus公司),核酸电泳仪电源上,通过核酸适体捕获HCVcore蛋白,再采用抗(北京博医康实验仪器有限公司),超滤离心机(中国HCVcore蛋白抗体和Cy3标记的二抗可实现HCVHealForce公司)、酶标仪(SpectraMaxM5,美国core蛋白的荧光检测,但并未给出可检测HCVcoreMolecularDevices公司).的浓度,同时发现使用sol-gel不利于RNA核酸适体2.2核酸适体的SELEX筛选的表面固定,使得捕获的HCVcore蛋白量减少
