传染性脾肾坏死病毒(isknv)vp092r的鉴定及功能研究

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1、中山大学博士学位论文传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）VP092R的鉴定及功能研究姓名：卢清侠申请学位级别：博士专业：水生生物学指导教师：何建国20090608摘要传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)VP092R的鉴定及功能研究专业：水生生物学博士生：卢清侠指导老师：何建国教授中文摘要传染性脾肾坏死病毒(InfectiousSpleenandKidneyNecrosisVirus，ISKNV)属于虹彩病毒科(iridoviridae)肿大细胞病毒属(Megalocytivirus)，是造成养殖鳜暴发性死亡的主要病原，给我国水产养殖业造成巨大的经济损

2、失。本实验室率先于2001年成功完成了ISKNV全基因组序列测定、ORF划分和序列分析工作，为ISKNV基因进行更深入研究奠定了基础。基于对ISKNV全基因组测序结果及生物信息学软件预测结果分析，本论文选定线粒体相关病毒基因ORF092l进行功能研究。通过RACE技术成功获得了该基因全长cDNA，确定其转录本位于ISKNV基因组的84394～85757bp处(全长1364bp)。使用ORF092R特异性RNA探针进行Northernblot分析，杂交得到一条与RACE结果大小一致的转录本。对ISKNV感染后ORF092R的转录时相分析表明，O

3、RF092R作为一个早期基因在病毒感染的早期阶段转录。使用自制的VP092R蛋白C端肽段抗体进行Westernblot及细胞免疫荧光实验，证实了VP092R蛋白在病毒感染的细胞中表达。RACE、Northernblot以及Westemblot等实验结果证实该基因在ISKNV感染的细胞中转录及表达。借助激光共聚焦显微镜观察及亚细胞组分分离方法，我们对该基因表达产物的亚细胞定位进行研究，实验结果显示VP092R蛋白为线粒体内膜定位蛋白，Il中山大学博士学位论文卢清侠其定位方向可能为N端朝向线粒体基质而C端朝向线粒体膜间隙。通过对其定位信号的研究我

4、们发现，该蛋白不具有典型的线粒体N端导肽序列，而跨膜区可能作为该蛋白内部的定位信号序列对于线粒体定位具有重要作用。VP092R蛋白线粒体定位的研究结果为我们深入挖掘与之相互作用的蛋白及可能参与的功能提供了一定的研究思路和线索提示。通过GSTPull—down实验，我们从斑马鱼线粒体鉴定出一个可与VP092R在体外特异性结合的蛋白，即线粒体热休克蛋白70(mtHSP70)。mtHSP70，也叫Mortalin／PBP74／GRP75，是热休克蛋白70家族成员，其功能涉及肿瘤发生、细胞凋亡、抗原处理以及调节血糖反应等多个方面。随后的免疫共沉淀实验

5、验证VP092R与BHK细胞内源性mtHSP70在体内相互作用，我们推测二者的相互作用可能影响下游肿瘤抑制蛋白p53的转录活性和功能。VP092R相互作用蛋白研究为揭示该病毒蛋白对宿主细胞相关机能的影响，探索病毒感染与宿主相互作用的机制奠定了基础。为研究该基因对细胞生理机能的影响，本论文筛选出稳定表达VP092R蛋白的稳定细胞系，进行C57BL／6小鼠肿瘤移植实验，对VP092R蛋白的促肿瘤生长作用进行初步研究，也为后续抗肿瘤药物的靶位点筛选奠定了基础。关键词：传染性脾肾坏死病毒，VP092R，线粒体定位，mtHSP70，促肿瘤生长111Ab

6、stractIdentificati{Lndcharacterizationof1。1’1”、092RdenticationanCaracterlzationOtVIt"2encodedbyInfectiousSpleenandKidneyNecrosisVirus(ISKNV)Major：HydrobiologyAuthor：LuQingxiaSupervisor：Prof．HeJianguoInfectiousspleenandkidneynecrosisvirus(ISKNV)isatypicalspeciesofthegenusMeg

7、alocytivirusinthefamilyiridoviridae，whichcausesapandemicandseriousdiseaseinmandarinfishandseveredamagetomandarinfishculturesinChina．Thecompletegenomesequencesandopenreadingframes(ORFs)organizationofISKNVhasbeendeterminedakeadyin2001．Basedoncompletegenomesequencingandbioinfo

8、rmaticalanalysisresults，mitochondria-associatedvirusgeneORF092Rwereidentifiedandch