苹果caspase-like基因家族的全基因组分析及平邑甜茶mhvpeγ基因的功能鉴定

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1、山东农业大学博士学位论文苹果caspase--like基因家族的全基因组分析及平邑甜茶MhVPEγ基因的功能鉴定姓名：冉昆申请学位级别：博士专业：果树学指导教师：杨洪强20120612尔农业人学fll；Ij学化沦文中文摘要细胞程序性死亡对于植物的正常牛长发育及环境适应过程具有十分重要的牛物学意义。最近的研究表明，subtilases、metacaspases和legumains为植物中的easpase-like蛋白酶，在植物细胞程序性死亡过程中起到类似caspases酶类的关键性调控作用。本研究以苹果基

2、因组数据库为载体，筛选并分析苹果中的3种caspase．1ike基因家族的种类及结构和功能；并以平邑甜茶为试材，分离得到MhVPEy基因，对其序列特征、表达模式和在水杨酸缓解镉胁迫中的作用以及转基因拟南芥对镉胁迫的响应做了初步研究。主要结果如下：(1)首先分析了苹果基因组中存在的3种caspase．1ike基因家族成员。利用牛物信息学的方法，在苹果中初步筛选并鉴定出63个subtilases，20个metacaspases．和13个legumains基因家族成员，并对其染色体定位、保守结构域和motif

3、．系统进化关系以及可能具有的牛物学功能等信息进行了分析和统计，为将来在苹果中深入研究easpasc-like基因的功能奠定了基础。(2)从平邑甜茶中分离得到液泡加工酶基因MhVPEy，该基因为营养型y-VPE类型，其开放阅读框编码一个494个氨基酸的蛋白，分子量为54kDa，具有一个保守的peptidaseC13结构域，且在N．端存在信号肽和跨膜区，C．端存在液泡锚定信号。(3)Insilico分析表明，MhVPEy的二级结构丰要由a．螺旋，p．折叠和无规则卷曲构成。MhVPE丫与羧酸肽酶Y存在直接相瓦

4、作用。(4)qRT．PCR和半定量RT．PCR证实，MhVPEy在平邑甜茶根、茎、叶和种子中均表达，但在成熟叶片中表达量最高。机械伤害、镉和水杨酸均能明显诱导MhVPEy的表达，而甲基荣莉酸效果不明显。(5)低浓度水杨酸可以缓解氯化镉对平邑甜茶幼苗的伤害，MhVPEy参与该过程，但是不通过肩动子甲基化水平的改变影响其表达。(6)构建了pBll21．MhVPEy正义及反义表达载体和pFGC5941一RNAi-Mhl／PEy以及pART27．RNAi．MhVPEy沉默表达载体，并成功转化拟南外。抗性和PCR

5、筛选以及RT-PCR结果均表明，MhVPEy已经在转基冈拟南芥中稳定表达。(7)过量表达MhVPEy的转基凶拟卣外较野牛型拟南芥、阡毋基因抑制表达的拟南芥和vpeko突变体拟南外的￡E长减缓，叶片数目变少：抑制表达阡研基因会增强转基队l拟南外对镉胁迫的抗性。关键词：caspase—like：全基因组分析；VPEv；基因分离：功能分析：平邑甜茶2Genome-wideanalysisofthecaspase-likegenefamiliesinappleandfuncfionalcharacterizat

6、ionofMhVPE7geneinM匝l傀shupehensisAbstractPr0跚medcelldeath(PCD)hasbeenprovedtoplayallimportantroleinplantno啪a1gro、Ⅳth，deVelopmentandenviromentaladaptiontoabioticorbioticstress．Recentstudiessnowthatsubtllases，metacaspasesandlegumainsarecaspase．1ikeproteases

7、exsitinginplants，whichareeSsentialfortheregulationofPCDprogressinplantssimilartocaspasein锄imaIs．1nthep潞蜘tstudy,weanalyzedthethreetpyesofthecaspase—likegene胁ilicsinapplegenome，卸dthen，a)，牌Egene，MhVPE?wasisolatedandcha豫cterizcd行om胁船以印砌e凇坫～。quencecomparison，

8、expressionanalysis，theroleintheproccssofcadmiumstressaIIeVlatedbysalicylicacid(SA)andfurtherfunctionalstudiesonthetransgenic月朋bidops坫thalinawereanalyzedinthiswork．Theobtainedresultsarcasfollows：⋯Ihr∞typesofthecaspase-likep