水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究

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分类号UDC学校代码10593学号1031304007彦匆火学学位论文水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究侯恩庆专业名称植物病理学学院名称农学院指导教师黄世文(研究员)黎起秦(教授)申请学位级别硕士论文提交日期2013．06论文答辩El期2013．05．22学位授予日期2013．06答辩委员会主席廖咏梅(教授)论文评阅人双盲评审 广西大学学位论文原创性和使用授权声明删本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料。与我一同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：口保密，在年解密后适用授权。函不保密。(请在以上相应方框内打“√")论文作者签名：名恩灰指导教师签名：撵壶豢作者联系电话：c卵争争67加易日期：幻l娣钼切融日期阳，岁争6月阳日电子邮箱：J!l眦吲侈阻；@，z多、钿 广西大掌硕士掌位论文水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究摘要近年来，全国各稻区普遍发生一种危害稻穗和谷粒的病害一水稻穗腐病(Ricespikeletrotdisease，RSRD)。该病由多种真菌引起，造成稻米腐坏、变色、畸形，致使结实率降低或不实，严重影响产量。还由于病原菌产生色素和毒素而改变稻谷外观，降低稻米品质。作者采集了浙江省杭州市和嘉兴市两地的水稻穗腐病样本，共鉴定出5种病原镰刀菌，并对各种镰刀菌的生物学特性、脂肪酸组成和含量、致病力、产毒条件和产毒能力、粗毒素毒性、田间防治进行了研究。获得主要研究结果如下：1．水稻穗腐病镰刀菌的分离和鉴定。共分离到216株镰刀菌，利用培养性状、形态特征观察和分子生物学手段共鉴定到5个镰刀菌种，包括：层出镰刀菌(Fproliferatum)、藤仓镰刀菌(Efujikuroi)、拟轮枝镰刀菌(Fverlicillioidess)、尖孢镰刀菌(Eoxysporum)和禾谷镰刀菌(Egraminearum)。其中，层出镰刀菌(Eproliferatum)137株，占63．4％；藤仓镰刀菌(Ffujikuroi)50株，占23．1％；拟轮枝镰刀菌(Fverticillioidess)21株，占9．7％；尖孢镰刀菌(Foxysporum)5株占2．3％；禾谷镰刀菌(Fgraminearum)3株，占1．4％。通过Koch法则验证，各种镰刀菌均能成功接种稻穗，使稻穗感染穗腐病。2．病原镰刀菌生物学特性。禾谷镰刀菌菌最适生长温度是25。C，最适pH为6，最佳碳源是葡萄糖、蔗糖，最佳氮源是尿素、硝酸钠；尖孢镰刀菌最适生长温度是25*(2，最适pH为6，最佳碳源是葡萄糖、蔗糖，最佳氮源是硝酸钠；层出镰刀菌最适生长温度是25"C，最适pH为6，最佳碳源是蔗糖、葡萄糖，最佳氮源是硝酸钠、亚硝酸钠；藤仓镰刀菌最适生长温度是25。C，最适pH为8，最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是硝酸钠：拟轮枝镰刀菌最适生长温度是25。C，最适pH为8，最佳碳源是蔗糖、葡糖糖、果糖，最佳氮源是硝酸钠、尿素。3．病原镰刀菌脂肪酸分析。应用Sherlock脂肪酸鉴定系统，总共检测出36种脂肪酸。SumInFeature3、16：00、SumInFeature5、18：1w9c和18：00为主要脂肪酸。 广西大掌硕士掌位论文水稻穗腐病锢E刀菌及相关毒素研究5种镰刀菌的脂肪酸组成及含量有一定的差异性，但不显著。因此，无法利用脂肪酸组成特征十分准确的将不同镰刀菌进行分类。4．病原镰刀菌致病力。通过病原菌孢子悬浮液接种水稻穗部试验，证明藤仓镰刀菌的致病力最强，拟轮枝镰刀菌、层出镰刀菌、禾谷镰刀菌次之，尖孢镰刀菌最弱。5．病原镰刀菌产毒能力和粗毒素毒性。禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌和层出镰刀菌的最佳产毒培养基为Richard培养基，最佳产毒温度为25℃，最佳产毒pH为6，最佳产毒培养时间为15天；藤仓镰刀菌和拟轮枝镰刀菌的最佳产毒培养基为Richard和PD培养基，最佳产毒温度为25。C，最佳产毒pH为8，最佳产毒培养时间为15天。利用活性炭吸附法提取了各种镰刀菌的粗毒素，并测试了粗毒素的毒性。藤仓镰刀菌粗毒素对水稻的毒害作用最强，尖孢镰刀菌最弱。利用ELLISA技术测定了粗毒素中伏马菌素(fumonisin)的含量。其中，藤仓镰刀菌粗毒素中伏马菌素含量最高，为5379．03ppm；拟轮枝镰刀菌次之，含量为638．62ppm：之后是禾谷镰刀菌禾谷镰刀菌，含量为139．39ppm；层出镰刀菌含量为13．87ppm；最后是尖孢镰刀菌，含量仅为2．16ppm。6．水稻穗腐病田间防治。用20％异噻菌胺悬浮剂(200ga．i．／ha)在分蘖盛期和孕穗末期各喷雾1次的防治效果最好，达到45．06％。25％咪鲜胺乳油+15％---唑酮乳油(112．25+90ga．i．／ha)孕穗末期和齐穗期各喷雾1次的防治效果并不理想，防效只有27．99％；25％咪鲜胺乳油+50％多菌灵可湿性粉剂(112．5+450ga．i．／ha)孕穗末期和齐穗期各喷雾1次的防治效果最差，防效仅有0．08％。关键词：水稻穗腐病；镰刀菌；致病力；生物学特性；脂肪酸；毒素；防治 广。西『大学硕士学位论文水稻穗腐病镰刀菌及相关毒；素研究StudiesonBiologicalCharacteristicsandToxinofRiceSpikeletRotDisease(asPa))PathogensFusariumspp．AbstractInrecentyears，theregenerallyOccursadiseaseinthericeplantingareaaroundChina，whichseriouslydamagesthepanicleandgrainofrice，andwegenerallycallitthericespikeletrotdisease(RSRD)．Thisdiseaseiscausedbyavarietyoffungi，andcouldcausethespoiling，discoloringanddeformityofricegrains，SOthesettingpercentagemaybereducedanditwillhaveastrongimpactonthericeproduction．Atthesametime，thericegrainsprobablelybedebasedbecauseofthepigmentandtoxinproducedbythepathogenicbacteria．Inthisstudy,infectedricespikeletsampleswerecollectedfromHangzhouandJiaxingcities，Zhejiangprovince，and216strainsofFusariumspp．wereisolated，andidentifiedbymorphologicalandmolecularbiologicalmethods．Theycouldbetotallydividedintofivespecies．Biologicalcharacteristics，fattyacidprofile，toxin．producingability,toxicityofcrudetoxin，andthemanagementoftheRSRDwerealsostudied．Theresultsareasfollows：1．IsolationandidentificationofRSRDpathogenicpathogens．216strainsofFusariumspp．wasisolatedfrominfectedricepaniclesamples．Theywereidentifiedanddividedintofivespecies，suchasEproliferatum．Ffujikuroi,Everticillioidess，Eoxysporum，andEgraminearum．Amongthese216strains，，therewere137strainsofEProliferatum，accountingfor63．4％，50strainswereEfujikuroi。accountingfor23．1％，21strainsbelongtoEverticillioidess，accountingfor9．7％。5strainsofEoxysporum，accountingfor2．3％，andonly3strainsofEgraminearum．accountingfor1．4％．ThepathogenicityofallisolatedstrainswasprovedaccordingtoKoch’Spostulates．2．BiologicalcharacteristicsoftheFusariumspecies．TheoptimumconditionofEgraminearumgrowthtemperatureis25。C，pHis6，the；；； 广西大掌硕士掌位论文水稻穗腐病镰刀菌及相关．青：素研究bestcarbonsourceisglucoseandsucrose，andthebestnitrogensourceisureaandsodiumnitrate．TheoptimumgrowthtemperatureofEoxysporumis25。C，pHis6，thebestcarbonsourceisglucoseandsucrose，andthebestnitrogensourceissodiumnitrate．TheoptimumgrowthtemperatureofEproliferatumis25*C，pHis6，thebestcarbonsourceissucroseandglucose，andthebestnitrogensourceissodiumnitrateandsodiumnitrite．TheoptimumgrowthtemperatureofFfujikuroiis25*C，pHis8，thebestcarbonsourceisglucose，andthebestnitrogensourceissodiumnitrate．TheoptimumgrowthtemperatureofEverticillioidessis25。C，pHis8，thebestcarbonsourceissucrose，glucoseandfructosesugar,andthebestnitrogensourceissodiumnitrateandurea．3．FattyacidprofileanalysisoftheFusariumspecies．36kindsoffattyacidsoftheisolatedFusariumwereanalyzedbythesherlockfattyacidsidentificationsystem．ThefattyacidsofSumInFeature3，16：00，SumInFeature5，18：1w9cand18：00arethemainfattyacids．ThecellularfattyacidsprofilesofthesefiveFusariumspeciesshoweddifferencesbutnotsignificant，andthedifferencewasnotenoughforFusariumspp．Identification．4．PathogenicityoftheFusariumspecies．ThepathogenicityofEfujikuroiisthestrongest，Everticillioidess,EproliferatumandEgraminearumareatsecondplaceandEoxysporumistheweakest．5．Toxin—producingcapacityoftheFusariumspeciesandtoxicityofthecrudetoxin．Thebesttoxin-producingconditionsforFgraminearum．EoxysporumandEproliferatumweretheRichardmedium，temperatureof25。C，pHof6，andcultivationfor15days．Similarly,forF．fujikuroandEverticillioidess，thebestconditionswereRichardandPDmediums，temperatureof25"C，pHof8，andcultivationfor15days．StudiesontheeffectofcrudetoxinagainstriceseedlingshowedthatthetoxicityofF．fujikurocrudetoxinisthestrongesttorice，andthetoxicityofEoxysporumcrudetoxinistheweakest．ThefumonisincontentinthecrudetoxinofEfujikuroisthehighestwhichreached5379．03ppm(}．tg／g)．Everticillioidess’Stakessecondplace，andthecontentis638．62ppm．Egraminearum’Stakesthirdplace，andthecontentis139．39ppm．InEproliferatum，thecontentis13．87ppm，yetinEoxysporum，thefumonisincontentistheleastanditisonly 厂‘西大掌硕士学位论文水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究2．16ppm．6．Preventionandcontrolofthericespikeletrotdiseaseinthefield．Thecontrolefficiencyisthebestandcouldbeupto45．06％，when20％isotianilsuspensionliquidsprayingatimebothinthetilleringstageandbootingstage．Thecontrolefficiencyisnotthatidealandonly27．99％，whenusingboth25％prochlorazand15％triadimefonspayingatimebothinthebootingstageandfullpaniclestage．Thecontrolefficiencyistheworstandonly0．08％，whenusingboth25％prochlorazand50％carbendazoiwettablepowderspayingatimebothinthebootingstageandfullpaniclestage．Keywords：RiceSpikeletRotDisease(RSRD)；Fusarium；Pathogenicity；Biologicalcharacteristic；Thecellularfattyacidsprofile；Fusariumtoxin；ControlofRSRDV 水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究目录1前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1水稻后期穗部病害⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l1．1．1稻曲病⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1．2稻粒黑粉病⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21．1．3水稻颖枯病⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21．2镰刀菌引起的禾谷类作物穗部病害⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．2．1玉米穗腐病⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．2．2小麦赤霉病⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．3水稻穗腐病主要研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41．4镰刀菌毒素研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．5本研究的目的与意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯72．1病害标本采集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．72．2供试水稻品种⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯72．3培养基⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯72．4试剂与药品⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯72．4．1分子鉴定试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．72．4．2脂肪酸分析试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．82．4．3伏马菌素检测试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．82．5主要仪器设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．6病原镰刀菌的分离和鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．6．1病原镰刀菌的分离、纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．92．6．2病原镰刀菌致病性测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．6．3病原镰刀菌鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．7病原镰刀菌的生物学特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112．7．1温度对病原镰刀菌生长的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11 水稻穗腐靖}镰刀菌及相关毒素研究2．7．2pH对病原镰刀菌生长的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．OO．．．．．．JOIaIO．．．．．．O0112．7．3不同碳源对病原镰刀菌生长的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．7．4不同氮源对病原镰刀菌生长的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．8病原镰刀菌的脂肪酸差异分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．122．8．1菌丝体制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．8．2脂肪酸抽提⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．8．3色谱分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．9病原镰刀菌的致病力研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．142．10病原镰刀菌产毒研究探索⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142．10．1粗毒素制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．142．10．2最佳产毒条件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．152．10．3粗毒素毒性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．162．10．4粗毒素中伏马菌素检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．162．1l水稻穗腐病大田防治⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172．11．1供试药剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．172．11．2试验处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．172．11．3调查与统计方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．173结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．183．1病原镰刀菌的分离和纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．183．2病原镰刀菌鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．183．2．1形态学鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯183．2．2分子鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223．3病原镰刀菌的生物学特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一243．3．1温度对病原镰刀菌生长的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．3．2pH对病原镰刀菌生长的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．283．3．3不同碳源对病原镰刀菌生长的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯313．3．4不同氮源对病原镰刀菌生长的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯343．4病原镰刀菌的脂肪酸差异分析探索⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．363．5病原镰刀菌的致病力研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．42 水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究3．6病原镰刀菌产毒研究探索⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一433．6．1最佳产毒条件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯433．6．2粗毒素的毒性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯473．6．3伏马菌素检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯503．7水稻穗腐病的防治⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．524讨论与结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．544．1水稻穗腐病侵染源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．544．2穗腐病镰刀菌生物学特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯544．3穗腐病镰刀菌脂肪酸组成分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯554．4穗腐病镰刀菌致病力分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．564．5穗腐病镰刀菌产毒探索⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．574．6水稻穗腐病的田间防治⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．584．7今后研究方向⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一58致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯60参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61附录：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．67 水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究1前言水稻是我国的主要粮食作物，其种植面积约占全国耕地总面积的29％，每年的稻米产量占粮食总产量的40％左右。我国是全世界最大的水稻生产和消费国之一，全国以大米为主食的人口不低于总人口的60％。因此，在我国农产品生产中和消费，水稻的地位尤为重要(黄发松，2002：Khushetal，2005)。据统计，每年因水稻病害而造成的产量损失为10％．15％，而水稻后期的穗部病害是导致减产的最直接和最严重的原因之一。其中，水稻穗腐病(Ricespikeletrotdisease，RSRD)是最主要的水稻后期穗部病害，且在全国各稻区普遍发生并有逐年上升和加重的趋势，尤其是长江中下游籼、粳稻混栽稻区和东北粳稻区。最初，层出镰刀菌(Fproliferatum)、澳大利亚平脐蠕孢菌(B．australiensis)、新月弯孢菌(Clunata)和细交链孢菌(彳．tenuis)被定为主要病原菌(刘恩勇，2011)，后经本人研究发现，除了层出镰刀菌(Fproliferatum)外，其他多种镰刀菌都可侵染水稻穗部和谷粒，引起水稻穗腐病。1．1水稻后期穗部病害除水稻穗腐病外，水稻后期稻穗病害主要有稻曲病、稻粒黑粉病和水稻颖(谷)枯病。其中水稻颖(谷)枯病可分为真菌性颍(谷)枯病(病原菌为Phomasorghina)和细菌性颖(谷)枯病(病原菌为Burkholderiaglumae)。1．1．1稻曲病稻曲病是水稻在生长后期穗部发生的一种病害(黄世文等，2002)，其病原菌为稻绿核菌(Ustilasinoideavirens)(Rushetal，2000)。该病病原菌侵染稻穗谷粒，感病谷粒被菌丝块包裹，大小为正常谷粒的3．4倍，初期为橙黄色，表面平滑，后期变为墨绿色，表面粗糙龟裂，内布满黑色粉状物。感病稻穗通常每穗1．5个病粒，严重时可多达数十粒，且田间病穗率超过10％(OUetal，1985)。稻绿核菌(Uvirens)主要以菌核形式在土壤中越冬，也可以厚垣孢子形式在感病谷粒内或健康谷粒颖壳上越冬。当菌核或厚垣孢子遇到合适的条件时，便可萌发行成子囊孢子和分生孢子，并在水稻扬花期侵染水稻花器和颖壳(赖传雅，2003)。防治稻曲病可用2％福尔马林、0．5％硫酸铜浸种或于水稻抽穗前用18％多菌酮粉剂、14％络氨铜水剂、5％井冈霉素水剂喷雾也能达到较好的防治效果(朱文达等，1996；左辉仕等，2005)。 水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究1．1．2稻粒黑粉病稻粒黑粉病的病原菌为狼尾草腥黑粉菌(7illet&barclayana)(方羽生等，2004)，该病原菌主要在水稻扬花期至灌浆期侵染水稻，初侵染时期症状不明显，至水稻黄熟时症状才容易识别(左震东，1990)。病原菌首先侵染水稻花柱，随后侵染子房和花器组织，病原菌菌丝紧贴谷粒糊粉层细胞或于糊粉层细胞之间生长蔓延，致使谷粒产生瘤状突起，并逐渐膨大呈球形或椭圆形。发病初期病粒表面呈污黄色或污绿色，后期病粒在颖壳缝隙形成黑色的舌状突起物或沿腹部开裂，并产生大量黑粉(陈毓苓等，1992；刘慧，2008)。感病稻穗通常每穗1．10粒病谷，严重时可多达数十粒。病原菌主要以冬孢子的形式粘附在种子和病株残体上或于田间土壤中越冬，存活时间可长达一年甚至更久(黄富，1992)。防治稻粒黑粉病的药剂主要有50％多菌灵粉剂、15％三唑酮乳油(刘命朔等，1994)，可在水稻抽穗扬花期喷雾防治(范西玉，1986：刘慧，2008)。1．1．3水稻颖(谷)枯病水稻颖(谷)枯病分为真菌性颖(谷)枯病和细菌性颖(谷)枯病，其病原菌分别为谷枯叶点霉菌(户sorghina)和颖壳伯克氏菌(B．glumae)(欧壮赫等，1999)。真菌性颖(谷)枯病病菌主要以分生孢子器的形式在染病谷粒上越冬(王国珍等，2007)，当条件适宜时，便以分生孢子为初侵染源，于水稻抽穗．杨花期侵染水稻谷粒的颖壳和花器，从而导致谷粒染病(王昌家等，2006)。若水稻抽穗．扬花期遇到强风暴雨天气，致使稻穗之间互相摩擦产生更多机械损伤，更有利于病原菌侵染，从而导致病害程度加重(OU，1981)：若偏施或过施氮肥，会延迟水稻成熟，同样也将增加病原菌侵染机率；还有在倒伏的田块，由于地面温湿度较高，也会提高病原菌侵染机率，导致病害程度加深(肖庆璞，1995：欧壮掂等，1999)。细菌性的颖(谷)枯病的染病谷粒初期出现白色萎蔫，类似缺水症状，并逐渐变为灰白色或浅褐色，谷粒颖壳顶端或基部变为紫褐色(Miyagawaetal，1998；『Shahjahanetal，2002)，后期感病谷粒表面有乳白色菌脓溢出，并伴随有难闻的臭味(Haetal，1993；谢关林等，2003)。若水稻前期染病，则茎部常伴有较短的倒生根，且病株一般在抽穗前枯死，少数能抽穗的病株稻穗畸形、谷粒不实(简锦忠，1983：Miyagawaetal，1998；徐丽慧，2008)。防治药剂可参照穗颈瘟(张晚兴等，1999)，也可用30％氧氯化铜悬浮剂或77％可杀得悬浮剂于始穗期和齐穗期各喷药一次，必要时也可在灌浆．乳熟期加喷一次，' 广西大学硕士学位论文水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究可以达到较好的防治效果(王玉坤，1999：刘金波等，2005)。1．2镰刀菌引起的禾谷类作物穗部病害镰刀菌属(Fusarium)为半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢纲(Hyphomycetes)、瘤座菌目(Tuberculariales)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)真菌，因其大型分生孢子多数呈镰刀状而得名(戴芳澜，1979；魏景超，1979；谢联辉，2006)。镰刀菌可侵染多种农作物及经济作物，且地理分布十分广泛，并在土壤和植物体内普遍存在(张向民等，2005)。据研究，有20多种镰刀菌可侵染禾谷类作物，主要有：禾谷镰刀菌(Fgraminearum)、黄色镰刀菌(Fculmorum)、雪腐镰刀菌(Fnivale)、燕麦镰刀菌(Favenaceum)等(Parryetal，1995；Miedaneretal，1997)。镰刀菌可引起的禾谷类作物穗部病害主要有：玉米穗腐病、小麦赤霉病和水稻穗腐病等。1．2．1玉米穗腐病玉米穗腐病是多种病原菌引起的病害(马秉元等，1998；陈捷，2000)，其病原镰刀菌主要有玉蜀黍赤霉菌(Gibberella2eae)、串珠赤霉菌(Gmoniliformis)、层出镰刀菌(Fproliferatum)和木贼镰刀菌(Fequiseti)等(卢维宏等，2010，201l；裴冬丽等，2011)。病原菌可侵染玉米果穗和籽粒引起玉米穗腐病。染病果穗顶部或中部变色，病原菌的菌丝体、分生孢子梗和分生孢子附着并覆盖其上，形成黑灰色、粉红色、黄褐色或暗褐色霉层(Logriecoetal，1995；李洪连等，1999)；染病籽粒不饱满，无光泽，质地较脆，内部多空虚并被菌丝体充塞；染病果穗病部苞叶多被密集的菌丝体贯穿而粘结于一起，并紧贴于果穗上，不易剥离(孔令晓等，1995)。仓储玉米被侵染后，粮堆内外长出颜色不同、疏密不均的菌丝体和分生孢子，并能闻到发霉的气味(李小平等，2007)。主要防治措施有：选择适当播种时期，避开病害高发期；合理密植，避免局部湿度较大；科学施肥，促进玉米早熟，提高抵抗力；结合虫害防治，降低伤口感染的机率。药剂防治可选用50％多菌灵可湿性粉剂或50％甲基硫菌灵可湿性粉剂，拌种或抽穗期至发病初喷洒均有较好的防治效果(宋伟彬等，2005)。1．2．2小麦赤霉病小麦赤霉病的主要病原菌为禾谷镰刀菌(Egraminearum)(Parryetal，1995；Miedaneretal，1997：喻璋，2002)。小麦幼苗至抽穗期均可感染赤霉病，引起苗枯、茎腐和穗腐等。染病小麦幼苗芽鞘和根鞘出现黄褐色水浸状病斑并逐渐腐烂，严重时整株幼苗枯死，后期病部长有粉红色霉层。小麦茎部病变主要发生在基部，初期呈褐 广西大掌硕士学位论文水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究色，随后变软腐烂，植株萎蔫甚至枯死，后期病部长有粉红色霉层(Miedaneretal，1997)。病菌侵染小麦穗部时，最初在小穗颖壳上出现灰褐色水浸状病斑，后逐渐扩大至整个麦穗，严重时整个麦穗枯死。若气候湿润，染病部位会长出粉红色胶状霉层，后期长出黑色小颗粒状子囊壳(喻璋，2002；侯明生等，2006)。赤霉病在全国麦区均有发生，长江中、下游冬麦区发病最为严重(喻璋，2002)。近年来，赤霉病在华北麦区的发生和危害有上升和加重的趋势，病害严重年份发病率高达50％．100％，造成10％．40％的产量损失。病原菌主要以菌丝体形式潜伏在小麦、高粱、玉米、豆类、芝麻、油菜、棉、麻及田间杂草残体或小麦种子内越冬。赤霉病的发生、流行与气候变化关系密切，若在小麦抽穗．扬花期至灌浆期遭遇连续阴雨天气，将大幅增加赤霉病发生机率。另外，若麦田地势低洼、土壤粘滞和排水不畅等引起湿度过高，也将利于病害的发生。药剂防治可选50％多菌灵可湿性粉剂、50％甲基硫菌灵可湿性粉剂和60％1甲霉灵可湿性粉剂等，拌种或于扬花期喷雾均有较好的防治效果(侯明生，2001)。1．3水稻穗腐病主要研究进展近年来，随着耕种制度和栽培措施的改变以及气候变暖的影响，大穗型粳稻和籼／粳杂交稻品种(组合)大面积推广种植，导致水稻穗腐病(RSRD)的发生及危害逐年加重，特别是长江中下游籼、粳稻混栽稻区和东北粳稻区。该病由多种真菌引起，造成稻米腐坏、变色、畸形，结实率降低或不实，引起水稻减产；由于病原菌本身带有颜色，进而影响稻米外观，降低稻米品质；病原菌可产生毒素，对食用者的安全和健康构成严重危害(Huangetal，2011；刘恩勇，201l；侯恩庆等，2013)。水稻穗腐病症状为：稻穗染病初期，谷粒颖壳产生黄褐色或铁锈色椭圆形小斑点，后逐渐扩大并变为褐色或黄褐色直至黑褐色，致使米粒畸形，有些伴有白色或粉色霉层。发病较早且较严重的稻穗不能结实，发病迟的则影响谷粒灌浆，导致秕粒增多，千粒重降低。过去穗腐病在各稻区多为零星发生，对水稻生产影响并不严重，因此未引起足够重视，少有对该病的系统研究，病害发生和危害情况不够明确，防治方法和防治药剂也不确定。自2006年起，本研究室对水稻穗腐病进行了数年的调查和研究。目前，全国有80万hm2水稻穗腐病常年发生田和1000万hm2轻度发生田，占全国水稻种植面积的1／3左右。若气候条件以及栽培措施等适宜病害发生，则会造成十分严重的危害(刘恩勇，2011；侯恩庆等，2013)。 水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究本实验室对水稻穗腐病的发生和流行原因进行了分析，并分离、鉴定了病原菌并检验了致病性，筛选了杀菌剂防治该病并进行了田间药效试验。结果表明，紧穗型的粳稻和籼／粳杂交稻品种(组合)比松散穗型的籼稻及其杂交品种(组合)更容易感病；水稻孕穗后期至抽穗．扬花期遇连续阴雨、高湿和温暖的天气会大大增加穗腐病的发生和危害；从水稻感病稻穗上分离到层出镰刀菌(Fproliferatum)、澳大利亚平脐蠕孢菌(B．australiensis)、新月弯孢菌(Clunata)和细交链孢菌(彳．tenuis)4中病菌，用分离到的4个菌根据Koch法则进行人工接种，4个菌均能使稻粒感病，并初步确定层出镰刀菌为穗腐病主要初侵染源(Huangetal，2011)；室内抑菌试验结果表明，浓度5ppm以上的50％多菌灵可湿性粉剂、45％咪鲜胺乳油和30％苯醚甲环唑·丙环唑乳油(爱苗)对层出镰刀菌(Fproliferatum)生长的抑制效果较好，可达81．31％．100％，抑制中浓度为0．0007．0．9476ppm；田间药效试验结果显示，选用20％三唑酮乳油、50％多菌灵可湿性粉剂或70％甲基托布津可湿性粉剂，在水稻孕穗后期和抽穗．扬花期各喷雾一次，防治效果在65％左右(刘恩勇，2011；黄世文等，2012)。1．4镰刀菌毒素研究镰刀菌引起的禾谷类农作物的穗腐病、赤霉病可产生毒素污染谷物籽粒(D’Melloetal，1997；陈石等，2011)。镰刀菌产生的毒素主要有伏马菌素(fumonisin)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等(D’Melloetal，1999；陈石等，2011)。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)为一种致呕吐物质，其结构为雪腐镰刀菌烯醇(nivalenol，NIV)的4．脱氧衍生物，又被称为呕吐毒素(Vomitoxin，VT)(胡南等，1997)。DON的耐藏力很强，具有较强的耐热性力和耐酸性，可长期保存于乙酸乙酯中，高压和碱处理可破坏其部分毒性(史建荣等，1997)。主要产毒菌为禾谷镰刀菌(Fgraminearum)和粉红镰刀菌(Froseum)等。DON具有很强的细胞毒性，会导致人、畜反应迟钝、厌食、腹泻、呕吐、发烧等急性中毒症状，也可影响免疫系统，中毒严重时可造成造血系统损害甚至死亡(裴自友等，2008；于洪宝等，2009)。伏马菌素(fumonisin)是一类由丙三羟酸和多氢醇组成的结构上相关的双酯化合物，耐热程度较强(D’Melloetal，1999；Jinetal，2007；吴剑威等，2008)。其主要产毒菌为串珠镰刀菌(Fmoniliforme)(Kelleretal，1997)。目前发现的伏马菌素共 水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究有11种，FA类2种、FB类4种、FC类4种FP类1种，其中FBI为主要种类(Kosteckietal，1999；Marinetal，1999；于洪宝等，2009)。伏马菌素(fumonisin)是一种致癌物(左春生，2006；Haoetal，2008)，主要损害肝、。肾功能(Lionetal，2006；Renetal，2007)，能导致猪肺水肿和马脑白质软化等症(Marinetal，1999；Wangetal，2002)，也可引起动物食道癌，给畜牧业造成严重威胁(Jiangetal，1998；肖前青等，2008：Cuietal，2006)。玉米赤霉烯酮(ZEN)因从有感染赤霉病的玉米中分离得到而得名，又被称作F．2毒素，具有较强的耐热性，在110℃条件下处理lh才能完全破坏其毒性(史文琦等，2011)。ZEN的产毒菌主要是禾谷镰刀菌(Fgraminearum)、三线镰刀菌(Ftrichwtum)等。ZEN主要污染小麦、大麦、玉米、大米、小米、燕麦等谷物(于洪宝等，2009)。ZEN具有雌激素作用，能对动物的生殖系统产生危害，造成动物急、慢性中毒，导致动物繁殖机能紊乱甚至死亡，也可引起中枢神经系统中毒，并发神智抑郁、共济失调、恶心、头痛等症状，给人和动物造成重大损害(肖前青等，2008)。1．5本研究的目的与意义水稻穗腐病不但影响水稻产量，而且降低稻米的品质。对水稻的生产和稻米市场价格造成严重影响。同时对人、畜、禽的健康和安全构成严重危害(黄世文等，2011)。发现水稻后期穗部谷粒变色及霉点的现象以由来己久，且近年来越来越严重，对水稻生产已经造成极大的危害。2008年前，穗腐病在全国各地均是零星发生，对水稻生产的危害不大。2008年、2009年该病在浙江、安徽、江苏、黑龙江等地部分品种(组合)上发生较为严重，并严重影响了水稻产量和稻米品质。本研究的目的为确定侵染水稻穗部的镰刀菌种类，明确其致病力和生物学特性，为致病机理、病害发生规律的研究打下基础，有助于科学指导病害防治工作；对各镰刀菌的产毒条件和能力进行探索，并检测粗毒素中伏马菌素的含量，防止人畜等受其危害；筛选出效果较好的防治药剂，提出相应的防控策略，为制定有效防控穗腐病的措施奠定基础。本研究对水稻穗腐病基础理论研究具有重要的推进作用。 水稻穗腐扁-m．72菌及相关毒素研究2材料与方法2．1病害标本采集取浙江省杭州市中国水稻研究所富阳试验基地A．D区和浙江省嘉兴市植保站试验田田间感病稻穗，并低温真空保存。供采样的水稻品种主要有“秀水09”(粳稻)、“甬优”和“春优”系列(籼粳杂交稻)、“国稻6号”(超级杂交稻)等品种(组合)。2．2供试水稻品种供试水稻品种为粳型常规稻“秀水09”(实验室自备，较感穗腐病品种)和籼型杂交稻“中浙优1号"(浙江勿忘农种业股份有限公司，较抗穗腐病品种)2．3培养基水琼脂培养基(WA)：蒸馏水1000mL，琼脂粉20g，高温高压灭菌(121℃，2．4×105Pa，20min)后使用。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：蒸馏水1000mL、马铃薯200g、琼脂粉20卧葡萄糖20g，高温高压灭菌(121℃，2．4x105Pa，20min)后使用。马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)：蒸馏水1000mL、马铃薯200g、葡萄糖20g，高温高压灭菌(121℃，2．4x105Pa，20min)后使用。Czapek培养基：蒸馏水1000mL、蔗糖30g、NaN032g、K2HP041g、KCIO．5g、MgS04·7H20O．5g、FeS040．01g，若制备固体培养基则加20g琼脂，高温高压灭菌(121℃，2．4×105Pa，20min)后使用。TSBA培养基：蒸馏水1000mL、胰蛋白大豆肉汤(TSB)30g、琼脂15g，高温高压灭菌(121℃，2．4x105Pa，20min)后使用。马铃薯蔗糖液体培养基(PSB)：蒸馏水1000mL、马铃薯200g、蔗糖20g，高温高压灭菌(121℃，2．4x105Pa，20min)后使用。Richard培养基：蒸馏水1000mL、蔗糖50昏KN0310昏KH2P045卧MgS04·7H202．5g、GZ2(S04)30．02g，高温高压灭菌(121℃，2．4x105Pa，20rain)后使用。2．4试剂与药品2．4．1分子鉴定试剂CTAB提取液：含O．7mol／LNaCI、20mmol／LEDTA、2．O％CTAB、0．1％D．巯基7 广西大掌硕士学位论文水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究乙醇、100mmol／LTris．HCI(pH8．0)(蒋盛岩等，2002)。配制方法为称取CTAB2．0g，加蒸馏水40mL，加1．0MTris—HCI(pH8．0)10mL、0．5MEDTA4mL和5．0MNaCI14mL，待CTAB完全溶解后，用蒸馏水定容至100mL，高温高压灭菌(121℃，2．4x105Pa，20rain)后加入0．1mL的B．巯基乙醇。氯仿／异戊醇混合液：按体积比24：1配制，即240mL氯仿中加入10mL异戊醇。CTAB沉淀液：含50mmol／LTris．HCl(pH8．0)、10mmol／LEDTA、1．0％CTAB。配制方法为称取EDTA1．0g，加蒸馏水20mL，加1．0MTris．HCI(pH8．0)5mL，O．5MEDTA2mL，待CTAB完全溶解后，用蒸馏水定容至100mL，高温高压灭菌(12l℃，2．4×10’Pa，20rain)后使用。2×TaqPCRGreenMix．"组分包含O．1U／pLTaqDNAPolymerase、2×反应缓冲液、3mMMgCl2、0．4mMdNTPs、指示剂，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司生产。PCR引物：efl(正向引物，5’．ATGGGTAAGGARGACAAGAC．3’)和e12(反向引物，5’．GGARGTACCAGTSATCATGTT．3’)由杭州博尚生物有限公司合成。其他试剂：DNAMarkerDL2000由上海莱枫生物科技有限公司生产，DNA回收试剂盒、pMD．18T载体试剂盒由宝生物工程(大连)有限公司生产。大肠杆菌(E．coli)DH5Gt感受态参照萨姆布鲁克等(2002)的文献《分子克隆实验指南》中的方法制备。2．4．2脂肪酸分析试剂试剂1(造化试剂)：NaOH(色谱纯)45g、甲醇(色谱纯)150mL、ddH20150mL，高温高压灭菌(121℃，2．4×105Pa，20rain)后使用。试剂2(甲基化试剂)：6．0NHCI(色谱纯)325mL、甲醇(色谱纯)275mL，高温高压灭菌(121℃，2．4x10’Pa，20rain)后使用。试剂3(萃取溶剂)：己烷(色谱纯)200mL、甲基叔丁基醚(色谱纯)200mL，高温高压灭菌(121℃，2．4×105Pa，20rain)后使用。试剂4(洗涤溶剂)：NaOH(色谱纯)10．8g、ddH20900mL，高温高压灭菌(121℃，2．4×105Pa，20min)后使用。试剂5(饱和NaCI溶液)：NaCI(色谱纯)40g、ddH20100mL，高温高压灭菌(121℃，2．4×105Pa，20min)后使用。2．4．3伏马菌素检测试剂伏马菌素高灵敏检测试剂盒RIDASCREEN⑩fumonisin(R3401)购于德国R-Biopharm公司。R 水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究2．5主要仪器设备超低温冰箱：DW．86L386，青岛海尔特种电器有限公司。超净工作台：SW-CJ．2FB，苏州净化设备有限公司。超声波清洗器：KQ．250DV，昆山市超声仪器有限公司。电热干燥箱：DHG．9070A，上海精宏实验设备有限公司。电泳仪：DYY-7C，北京市六一仪器厂。电子天平：BS224S，德国Sartorius公司；PL3002，梅特勒．托利多仪器(上海)有限公司。高速冷冻离心机：3K15，德国Sigma公司。高压灭菌锅：MLS．378，日本Sanyo公司。恒温混匀仪：MSC．100，杭州奥盛仪器有限公司。恒温水浴锅：ST-3D，新西兰Seedtech公司。恒温摇床：HYG．A，太仓实验设备厂；THZ．C，太仓实验设备厂；THZ．C．1，太仓实验设备厂。酶标仪：InfiniteM200PRO，瑞士Tecan公司。凝胶成像系统：FR．200A，上海复日科技有限公司。PCR扩增仪：EDC．810，东胜创新生物科技有限公司。pH计：PB．10，德国Sartorius公司。气相色谱仪：7890A，安捷伦科技(中国)有限公司。人工气候培养箱：ZRX．300ESW，杭州钱江仪器设备有限公司。显微镜：DM1000，德国Leica公司；CX31，日本Olympus公司；SZ61，日本Olympus公司。旋转蒸发仪：RE．52B，上海亚荣生化仪器厂。制冰机：XB70，美国Grant公司。自动洗板机：WD．2103A，北京市六一仪器厂。2．6病原镰刀菌的分离和鉴定2．6．1病原镰刀菌的分离、纯化在超净工作台中，将发病稻谷用清水冲洗干净进行表面消毒(70％酒精消毒4-6S，O．1％HgCl2消毒2min)，之后用无菌水冲洗2．3遍，用灭菌的滤纸将水分吸干。将表 水稻穗腐病镰．Tj菌及相关毒素研究面消毒处理的谷粒颖壳病健交界处切开(方中达，1998)，放在WA培养基上25℃培养。每个样本3次重复，用健康的谷粒作为对照。菌落形成后，挑取菌落边缘菌丝体，转接于PDA平板上进一步培养，经过单孢子分离纯化后，获得纯化镰刀菌株，保存备用(刘恩勇，2011)。2．6．2病原镰刀菌致病性测定分别将分离纯化得到的病原菌株制备成1×105mL。孢子悬浮液。在水稻开花当天进行人工喷雾接种，每穗喷雾5mL孢子悬浮液，接种穗套袋，以喷雾清水的稻穗作为对照，每个处理进行3次重复。接种7d后调查发病情况。致病性试验在温室进行，供试水稻品种为“秀水09”(较感品种)。取接种发病谷粒，按2．6．1所述方法再分离和纯化病原菌，获得再分离菌株，并确认在相同的培养条件下(PDA、25℃、7d)再分离菌株与原接种菌株的形态相同。2．6．3病原镰刀菌鉴定2．6．3．1形态学鉴定将纯化菌株在PDA平板上25。C恒温培养7d，观察菌株的菌落形态、质地、色泽，显微镜下观察菌株的分生孢子形态，随机测量50个孢子大小，并与文献进行对比。2．6．3．2分子鉴定获得菌丝体：将纯化的供试菌株在PDA平板上25℃培养3d，用灭菌的打孔器切取菌落边缘5mm直径的菌饼，转接到装有100mLPDB的三角瓶中，恒温摇床振荡培养(25。C、120r／min)2．3d。用抽滤瓶滤出菌丝体，然后用灭菌的滤纸将菌丝体中的水分吸干，转入灭菌的2mL离心管中保存备用。CTAB法提取菌丝总DNA：(1)取0．29菌丝于研钵中，用液氮充分研磨菌丝，分装于灭菌的离心管中；(2)加800gLCTAB提取液，在恒温水浴锅中65。C水浴30min，10000r／min离心10min；(3)移取上清液至新的离心管中，加入等体积的氯仿／异戊醇混合液，充分摇匀，10000r／min离心10min；(4)重复步骤(3)；(5)移取上清液至新的离心管中，加等体积的CTAB沉淀液，充分混匀，10000r／min离心10min；(6)弃上清液，加300gL的1．0mol／LNaCI溶液，使沉淀重新溶解；(7)加等体积的氯仿／异戊醇混合液，充分摇匀，静置10min使沉淀完全溶解，10000r／min离心10min；(8)移取上清液，加2．5倍体积的冰冻无水乙醇，产生絮状沉淀物，10000r／min离心10rain：(9)弃上清液，用70％酒精洗沉淀物2．3次，晾干，加60此ddH201n 水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究溶解沉淀；(10)取5此DNA溶液，1％琼脂糖凝胶电泳30min检测DNA纯度，剩余样品．20℃保存备用。转录延伸因子(Transcriptionalelongationfactor，TEF)序列PCR扩增：用引物efl(正向引物，5’．ATGGGTAAGGARGACAAGAC．3’)和ef2(反向引物，5’．GGARGTACCAGTSATCATGTT．3’)扩增供试菌株的TEF片段(Geiseretal，2004)。扩增体系：引物efllpL、引物ef2l儿、DNA模板llaL、2xTaqPCRGreenMix10此、ddH207肚，总体积为20此。扩增程序：94。C预变性3min，94。C变性30S，53*C退火30S，72℃延伸50S，共35个循环，然后72℃延伸10min。取5此PCR产物，以DNAMarkerDL2000为标准，用1％琼脂糖凝胶电泳30min，待电泳结束，拍照记录结果(王晓英等，2005：Geiseretal，2004)。TEF序列分析：将PCR产物电泳的目的片段回收纯化，用pMD．18T载体链接，并转入大肠杆菌(E．coli)DH5a菌株上，筛选出含目的片段的大肠杆菌(E．coli)DH5a菌株进行培养(萨姆布鲁克J．，2002)，将菌液送至杭州博尚生物有限公司进行测序。测序结果通过BLAST(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov)与GenBank中的核苷酸序列进行分析，用MEGA4．0软件将供试菌株序列与同供试菌株序列相似的菌株序列进行同源性比较，构建系统进化树。2．7病原镰刀菌的生物学特性2．7．1温度对病原镰刀菌生长的影响将5mm的病原菌菌饼(获得菌饼方法同2．6．3．2)接入PDA平板正中央，分别置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃条件下恒温培养，每个处理3次重复。5d后测量菌落直径，采用十字交叉法，两次测量计算平均值即为菌落直径长度(刘恩勇，2011)o2．7．2pH对病原镰刀菌生长的影响每个三角瓶中装100mLPDB培养基，高压灭菌(121℃，2．4×105Pa，20min)后，将PDB培养基pH分别调至4、5、6、7、8、9、10、l1，将5mm病原菌菌饼(获得菌饼方法同2．6．3．2)接入调好pH的PDB培养基中，25。C恒温静置培养5d，将PDB培养基滤去，60℃、12h烘干菌丝体，称量菌丝体干重(卢维宏，2011)，每个处理3次重复。 水稻穗腐病-m．72菌及相关毒素研究2．7．3不同碳源对病原镰刀菌生长的影响以Czapek固体培养基为基准，分别加入淀粉、果糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖7种不同的碳源，以代替Czapek培养基中的蔗糖，制成7种不同碳源的培养基(刘恩勇，2011)。将病原菌的菌饼(获得菌饼方法同2．6．3．2)分别接入不同碳源培养基制成的平板中央，25。C培养5d，观察记录菌株生长状况及菌丝丰度(王洪臣，1997)，测量菌落直径(方法同2．7．1)，以不加碳源的平板为对照，每个处理3次重复。表2．1气生菌丝丰度分级标准(王洪臣，1997)Table2．1Classificationstandardforrichnessofaerialmycelium等级Classification气生菌丝生长状况Thegrowthmorphologyofaerialmycelium第0级第A级第B级第C级第D级第E级第F级没有；所有絮体上都未发现丝状菌很少：个别絮体上发现丝状菌一些：不是每个絮体上都有丝状菌一般；每个絮体上都有菌丝l到5根，密度较低较多：每个絮体上都有菌丝5到20根，中等密度丰富；每个絮体上都有菌丝超过20根，密度很高大量：大量菌丝形成丝网2．7．4不同氮源对病原镰刀菌生长的影响以Czapek固体培养基为基准，分别加入硫酸铵、尿素、脯氨酸、天门冬素、硝酸钠、亚硝酸钠、组氨酸7种不同的氮源以代替Czapek培养基中的硝酸钠，制成7种不同氮源的培养基(刘恩勇，2011)。将病原菌的菌饼(获得菌饼方法同2．6．3．2)分别接入不同氮源培养基制成的平板中央，25℃培养5d，观察记录菌株生长状况，测量菌落直径(方法同2．7．1)，以不加氮源的平板为对照，每个处理3次重复。2．8病原镰刀菌的脂肪酸差异分析2．8．1菌丝体制备将高温高压灭菌(121℃，2．4×105Pa，20min)的玻璃纸平铺在TSBA(或PDA)平板上，接5mm的病原菌菌饼(获得菌饼方法同2．6．3．2)到玻璃纸上，25℃培养7d，将菌丝体刮下，．20℃保存备用。 广西大掌硕士掌位论文水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究2．8．2脂肪酸抽提皂化：(1)将0．2g菌丝体研磨加入特氟荣(Teflon-lined)试管中；(2)加1．0mL试剂1加入试管中，盖上盖子密封，漩涡震荡5min：(3)100。C沸水浴5min，漩涡震荡5min，(4)100"(2沸水浴25min，冷却至室温。甲基化：(1)加入2．0mL试剂2到试管中，盖上盖子密封，漩涡震荡5min；(2)80"(2水浴加热10min；(3)快速冷水冷却，变冷却边摇晃。萃取：(1)加入1．25mL试剂3到试管中，盖上盖子密封；(2)放置旋转器上温和旋转10min；(3)打开盖子，用干净的玻璃管去除样品下半部的亲水部分。碱液洗涤：(1)加入3．0mL试剂4到试管中，盖上盖子密封；(2)放置旋转器上温和旋转5min；(3)加试剂5到试管中，静置分层；(4)利用干净的玻璃管吸取上层透明溶液的2／3加入到Agilent小瓶中(SherlockMicrobialIdentificationSystem，2002)。2．8．3色谱分析将抽提得的脂肪酸溶液进行气相色谱(GC)分析，通过MIDI系统的脂肪酸分析软件SherlockMIS6．0(microbialidentificationsystem)在如下色谱条件下分析脂肪酸标准品和待检样品：起始柱温为170℃，每分钟5℃提升至260℃，随后每分钟40*(2提升至310"(2，持续90s；汽化室温度为250℃，检测器(Detector)温度为300℃：载气为氢气(H22mL·min。1)，尾吹气为氮气(N230mL·min。)；柱前压为lOpsi(68．95kPa)；进样量为10此，进样分流比为100：1(SherlockMicrobialIdentificationSystem，2002；刘国红等，2012)。操作步骤如下：(1)打开H2、N2、空气钢瓶的气阀，并调节分压阀，使H2和N2示数为O．35左右，空气的示数为0．42左右。(2)开启仪器气相色谱仪电源，开启电脑。(3)将标准品和脂肪酸样品放置到仪器样盘中。(4)打开sherlocksampleprocessor，编辑样品信息，选择方法，status项选择为Queued，等待编辑结束后锁上编辑的表格(LackTable)，避免误操作。(5)确认标准品放在样品盘的第一个位置，样品顺序跟表格一致，洗液(正己烷)己放好(在A位)，液面在2／3以上，废液瓶为空(在W位)。(6)startbathch，软件自动调用GC软件，开始进样。l3 广西大掌硕士学位论文水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究(7)最小化记录窗口，通过窗口instrumentlonline观看一起参数(View⋯onlinesignals⋯signalwindow1)。(8)全部样品结束后，关闭sherlocksampleprocessor程序，打开Instrumentlonline程序，设置如下关机参数：1)进样口(Inlet)：关掉加热(Heater)，点击apply，此处切记不可关闭气流参数(Pressure和TotalFlow)；2)炉温(Oven)：设置至40。C，点击apply；3)检测口(Detector)：关掉加热(Heater)和火焰(Flame)，点击apply。(9)待进样口(Inlet)温度降至100℃以下，炉温(Oven)降至40℃，检测器(Detector)温度降至100摄氏度以下，关闭程序InstrumentIonline，关闭仪器(GC)。(10)关闭电脑，关闭气体(H2最后关)，关闭总阀(SherlockMicrobialIdentificationSystem，2002)。2．9病原镰刀菌的致病力研究水稻孕穗后期进行套袋处理，在抽穗．扬花期采用人工喷雾接种的方法对稻穗进行接种(方法同2．6．2)，7d后调查每穗病粒率和发病等级，并根据病害等级计算出病情指数(袁婷露等，2008)。供试水稻品种为“秀水09”和“中浙优1号”。病害分级标准：将病害等级分成9级，标准见表2．2。表2．2水稻穗腐病病害分级标准Table2-2Severityratingstandardforricespikeletrotdisease(RSRD)2．10病原镰刀菌产毒研究探索2．10．1粗毒素制备毒素原液制备：将菌菌饼(获得菌饼方法同2．6．3．2)接入Richard培养基，摇床(25。C，120r／min)培养15d，滤去菌丝，滤液高温高压灭菌(121℃，2．4×105Pa，2014 广西大掌硕士学位论文水稻穗腐病镰刀菌及相关毒。繁研究min)备用(陆鸣等，1992：田雪亮等，2006；李俊霞等，2011)。粗毒素制备：采用活性炭吸附法，200mL毒素原液中加入活性炭50g，4℃处理24h，滤掉溶液，加100mL甲醇浸泡活性炭(3次重复)，除去不容物，用旋转蒸发仪65℃、20ffmin减压浓缩甲醇溶液至褐色即为粗毒素，4℃保存备用(陆鸣等，1992：袁树忠等，2011)。2．10．2最佳产毒条件本次试验采用毒素原液对水稻种子胚根的生长抑制率来代表粗毒素浓度大小(陆鸣等，1992；田雪亮等，2006；李俊霞等，2011)。将上述毒素原液分别取lOmL加入铺两层无菌滤纸的培养皿中，每皿放入10粒催芽至露白的水稻种子，用无菌水作为对照处理，25℃保湿培养5天，测量种子根长，每个处理3次重复，供试水稻品种为“秀水09”。根抑制率(％)=(对照种子平均根长．处理种子平均根长)÷对照种子平均根长x1002．10．2．1培养基将每种病原菌菌饼(获得菌饼方法同2．6．3．2)在无菌条件下分别接入装有200mLPDB、PSB、Richard、Czapek培养基的三角瓶中，摇床25℃、120r／min培养15d，滤去菌丝体，滤液高温高压灭菌(121℃，2．4×105Pa，20min)后4℃保存备用(陆鸣等，1992；李俊霞等，2011)。2．10．2．2温度将每种病原菌菌饼(获得菌饼方法同2．6．3．2)在无菌条件下接入装有200mLRichard培养基的三角瓶中，将摇床温度设定成10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃6个不同处理，120r／min培养15d，滤去菌丝体，滤液高温高压灭菌(121℃，2．4x105Pa，20min)后4℃保存备用(陆鸣等，1992；李俊霞等，2011)。2．10．2．3pH将灭菌后的Richard培养基pH分别调至4、5、6、7、8、9、10，分装至灭菌的三角瓶中，每瓶200mL，无菌条件下接入各种病原菌菌饼(获得菌饼方法同2．6．3．2)，摇床25℃、120r／min培养15d，滤去菌丝体，滤液高温高压灭菌(121℃，2．4x105Pa，20min)后4℃保存备用(陆呜等，1992：李俊霞等，2011)。2．1O．2．4培养时间将每种病原菌菌饼(获得菌饼方法同2．6．3．2)在无菌条件下分别接入装有200mLRichard培养基的三角瓶中，摇床25℃、120dmin培养，分别培养5d、10d、15d、15 水稻穗盾}病镰刀菌及相关毒素研究20d、25d、30d后，滤去菌丝体，滤液高温高压灭菌(121℃，2．4x105Pa，20min)，4。C保存备用(刘艳等，2009)。2．10．3粗毒素的毒性分析2．10．3．1对种子发芽率的影响按各种病原镰刀菌的最佳产毒条件制备粗毒素原液。按照2．10．2的方法计算根抑制率和芽抑制率。芽抑制率(％)=(对照种子平均芽长．处理种子平均芽长)÷对照种子平均芽长×1002．10．3．2对幼苗的毒害作用育秧盘中培育“秀水09”秧苗，待幼苗长至2叶l心时，将幼苗取出，无菌水将幼苗根洗净，放入试管(5×100mm)中，加入10mL的营养液(范锃岚，2012)，各取0．1mL的粗毒素加入试管中，以加0．1mL无菌水为对照，每个处理3次重复，25℃、光照培养，5d后观察记录幼苗发病情况(田雪亮等，2006)(发病等级标准见表2．3)。表2．3毒素对幼苗毒害的分级标准(田雪亮等，2006)Table2-3Severityratingstandardofeffectsofcrudetoxinonriceseedling病级Rates幼苗症状Symptomsofriceseedling幼苗叶片无萎蔫；根尖正常幼苗1叶萎蔫，1叶叶尖黄化：根尖正常幼苗1叶萎蔫，l叶整叶黄化：根尖正常幼苗l叶黄化萎蔫，l叶黄化枯死：根尖出现褐点幼苗基本枯死；根尖褐变坏死2．10．3．3对稻穗的毒害作用保鲜盒中(9×16x16cm)中平铺2层滤纸，喷雾无菌水湿润滤纸。取刚刚抽穗的水稻稻穗，采取颖壳注射法接种稀释100倍的粗毒素溶液2mL，以注射无菌水2mL为对照，每个处理3次重复。将接种后的稻穗放入保鲜盒中，盖上盖子，25℃、光照、保湿培养，观察记录稻穗生长状况。2．10．4粗毒素伏马菌素检测按各种病原镰刀菌的最佳产毒条件制备粗毒素。分别将每份粗毒素稀释100、1000、10000倍，共得15份毒素样品。用伏马菌素高灵敏检测试剂盒RIDASCREEN⑩16 广西大掌硕士掌位论文水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究fumonisin(R3401)通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定以上15份毒素样品中伏马菌素的含量，每个处理3个重复。ELISA检测方法步骤：(1)加50此标准样品(试剂盒自备)和待测毒素样品于96孔板微孔中；(2)每孔加50此的标记物；(3)每孔加50gL的抗体；(4)将微孔板放置于恒温混匀仪上，室温(20．25℃)、黑暗孵育30min；(5)用微孔洗板机洗板2．3次，洗掉未连接的酶标记物；(6)每孔加100gL发色试剂；(7)将微孔板放置于恒温混匀仪上，室温(20．25℃)、黑暗孵育15rain；(8)每孔加100uL的反应停止液，充分混匀，10min后，用酶标仪在450nm处，测各微孔吸光值；(9)计算百分吸光度值(百分吸光度值(％)=各样品吸光度值÷0标准样品吸光度值X100)，绘制标准曲线，算出各粗毒素样品中伏马菌素的含量(吴杰等，2009)。2．11水稻穗腐病大田防治2．11．1供试药剂①20％异噻菌胺悬浮剂(拜耳作物科学(中国)有限公司)。②80％乙膦铝水分散粒剂(拜耳作物科学(中国)有限公司)。③25％肟菌酯+50％戊唑醇水分散粒剂(75％拿敌稳水分散粒剂，拜耳作物科学(中国)有限公司)。④3％多抗霉素可湿性粉剂(兴农药业(中国)有限公司)。⑤25％咪鲜胺乳油(浙江瑞丰园生物科技有限公司)。⑥15％三唑酮乳油(江苏建农农药化工有限公司)。⑦50％多菌灵可湿性粉剂(浙江泰达作物科技有限公司)。2．11．2试验处理本试验于2012年4一11月份在中国水稻研究所富阳试验基地转基因试验田进行，试验水稻品种为“秀水09”，采用移栽方式，每小区25m2，常规肥水管理，试验区内不施用任何其它杀菌剂，每个处理3次重复，随机区组排列(刘恩勇，2011)。药剂处理与施药方法见表2．4。2．11．3调查与统计方法待水稻生长至黄熟期，按5点取样法抽样调查每个小区水稻穗腐病的发病情况，每点调查5丛，统计每穗发病粒数和发病等级(分级标准同2．9)，并计算病情指数和防效，经过DPS数据处理系统进行分析(唐启义等，2010)。 广西大掌硕士学位论文水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究注：1．处理4，6，7，8中，若两药在同一时期施用，则为现混现用。2．药剂：①，20％异噻菌胺sc．②，80％膦铝WG．③，25％肟茵酯+50％戊唑醇WG(75％拿敌稳WG)．④，3％多抗霉素wP．⑤．25％咪鲜胺EC．⑥，15％三-唑酮EC．⑦，50％多菌灵WP．Note：1．Mixthetwofungicideswhenspraythematthesametimeoftreatments4，6，7，8．2．Fungicides：①，20％lsotianilSC．②，80％Fosetyl．aluminiumWG．③，25％Trifloxystrobin+50％TebuconazoleWG．④，3％PolyoxinwP．⑤，25％ProchlorazEc．⑥，l5％TriadimefonEC．⑦，50％CarbendazimWP18 水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究3结果与分析3．1病原镰刀菌的分离和纯化共采集感病水稻样品200份(水稻所试验田160份，嘉兴试验田40份)，从样品中分离并纯化获得镰刀菌菌株216株(水稻所试验田171株，嘉兴试验田45株)。将216株镰刀菌菌株接种水稻稻穗，均可浸染水稻谷粒，引起谷粒病变。从接种发病谷粒中再分离的菌株与原接种菌株在PDA平板上的菌落形态完全一致，大、小型分生孢子相当，结果满足Koch法则，证明所得216株菌株均为水稻穗腐病的病原菌。3．2病原镰刀菌鉴定3．2．1形态学鉴定(1)GZl、GZ2、GZ33株镰刀菌的菌落圆形，棉絮状或毛毡状，菌丝体初期白色，生长旺盛，后期变为淡紫色或淡粉色，可扩展至整个培养皿。大型分生孢子呈镰刀形或纺锤形，3．5个隔膜，基部有足胞，大小为19．1．48J3“rn×2．3—5．2run(平均32．3pmx3．4“m)；小型分生孢子卵圆形、长椭圆形等，O．2隔膜，5．2．13．2岬×2．3．4．81．tm(平均8．2I．tmx3．2Ltm)。供试菌株与禾谷镰刀菌禾谷镰刀菌(Fgraminearum)有性态为玉蜀黍赤霉菌(Gzeae)(魏景超，1979；陈鸿逵等，1992；Leslieetal，2006)形态相吻合(图3-1)。(2)F01、F02、F03等5株镰刀菌的菌落圆形，突起，棉絮状或毛毡状，菌丝白色质密，菌落前期白色，后期肉色，略带有紫色，可扩展至整个培养皿。大型分生孢子镰刀形，细长，少许弯曲，基部有足胞，多数为3-6隔，大小为19．3．51．4岬×3．0．4．0pm(平均40．1pro×3．2岬)：小型分生孢子较少，长卵形、肾形等，无隔膜，大小为5．0—12．0btm×2．1-4．51．tm(平均7．8l上mx3．0“m)。供试菌株与尖孢镰刀菌(Foxysporum)(陈鸿逵等，1992；Summerelletal，eta1．；2003；肖荣凤等，2008)形态相吻合(图3—2)。(3)FPl、FP2、FP3等137株镰刀菌的菌落圆形，毛毡：吠，菌丝体白色，后期中央菌丝体转为淡紫色或紫色，边缘菌丝转为肉色或淡粉色。大型分生孢子数量少，呈镰刀形或纺锤形，具3-6个隔膜，大小为19．6．49．41．tmx3．0—4．7lam(平均34．6lamx3．5I．tm)：小型分生孢子呈椭圆形、卵圆形、梨形等，O．2个隔膜，大小为5．2—14．0bu'nx2．2．5．11q 广西大掌硕士学位论文水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究gm(平均8．4gmx3．3pm)。供试菌株形态与层出镰刀菌(Eproliferatum)(魏景超，1979；陈鸿逵等，1992；Leslieetal，2006)相吻合(图3．3)。磬震?黪踺}。1蛳m：伊【■I1蛳m；日。图3—1菌株GZl形态和培养性状Fig3-1MorphologicalandculturalcharacteristicsofisolateGZ1图3-2菌株F01形态和培养性状Fig3-2MorphologicalandculturalcharacteristicsofisolateFO1图3-3菌株FPl形态和培养性状Fig3-3MorphologicalandculturalcharacteristicsofisolateFP120 。西大掌硕士学位论文水稻穗腐病镰刀r菌及相关毒素研究篷图3—4菌株GFl形态和培养性状Fig3-4MorphologicalandculturalcharacteristicsfisolateGF1黻斟吣0／t二‘酝·s伽炯图3．5菌株GMl形态和培养性状Fig3-5MorphologicalandculturalcharacteristicsfisolateGM1(4)GFl、GF2、GF3等50株镰刀菌的菌落圆形，突起，棉絮状或毛毡状，菌鱼白色，生长旺盛，后期变为淡粉色或奶油色，可扩展至整个培养皿。未发现大型分E孢子；小型分生孢子长椭圆形、卵圆形、梨形等，无隔膜，大小为4．4—11．6pmx2．3．4．6m(平均7．5pmx3．1“m)。供试菌株形态与藤仓镰刀菌(Efidikuroi)有性态为藤仓齐霉菌(6：fujikuroi)(沈亚恒等，2006；Leslieetal，2006：吕国忠等，2010)相吻}(图3．4)。(5)GMl、GM2、GM3等21株镰刀菌的菌落圆形，突起，棉絮状或毛毡状，卣丝体白色，生长旺盛，后期变为淡粉色或肉色，可扩展至整个培养皿。未发现大型}生孢子：小型分生孢子呈卵圆形、长椭圆形等，0．1隔膜，大小：为4．6—11．5pmx2．4．4．7。ji。峪醺一繇 广西大掌硕士掌位论文水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究pm(平均7．7¨m×3．1pm)。供试菌株形态与拟轮枝镰刀菌(Fverticillioidess)有性态为串珠赤霉菌(Gmonoliformis)(Leslieetal，2006；吕国忠等，2010)相吻合(图3．5)。3．2．2分子鉴定利用TEF序列的通用引物en和e12对216供试株镰刀菌菌株的DNA样本进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳结果表明PCR扩增产物的大小在700bp左右。测序结果：GZl、GZ2、GZ33株试菌株的TEF区段为708bp；F01、F02、F03等5株供试镰刀菌的TEF区段为711bp；FPl、FP2、FP3等137株供试镰刀菌的TEF区段为710bp；GFl、GF2、GF3等50株供试菌株的TEF区段为704bp；GMl、GM2、GM3等21株供试菌株的TEF区段为710bp。图3—6病原镰刀菌TEF片段PCR产物电泳图注：1，菌株GZl．2，菌株GZ2．3，菌株GZ3．4，菌株F01．5，菌株F02．6，菌株F03．7，菌株FPI．8，菌株FP2．9，菌株FP3．10，菌株GFI．11，菌株GF2．12，菌株GF3．13，菌株GMl．14，菌株GM2．15，菌株GM3．M，DNAMarker．Fig3-6ElectrophoreticanalysisofPCRproductsofTEFsequenceofisolatedFusariumstrainsNote：1，IsolateGZl．2，IsolateGZ2．3，IsolateGZ3．4，IsolateF01．5，IsolateF02．6，IsolateF03．7，IsolateFPl．8，IsolateFP2．9，IsolateFP3．10，IsolateGFl．11，IsolateGF2．12，IsolateGF3．13，IsolateGMl．14，IsolateGM2．15，IsolateGM3．M，DNAMarker．22 广西大掌硕士掌位论文水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究FPlFP3F．proliferatum(JQ639205)F．proliferatum(J,XB68959)FP2GM2GM3G．moniliformis(JN090163)G．moniliformis(JQ639208)GMlF02F03F01F．oxysporum(AB674272)F．oxysporum(JQ∞54491F．avenaceum(HQ020459)F．avenaceum(HQ020467)F．miscanthi(HF674997)F．miscanthi(HF674998)G．fujikumi(JF699611)GF3G，蜘ikuroi(JF270254)GFlGF2G．zeae(HM744693)F．sporotfichioides(HM744663)F．sporotnchioides(HM744687)G乃G．zeae(JF747146)GZlGZ2F．equiseti(GQ848543)F．equiseti(GQ848547)M．anisopliae(KC520539)图3．7基于TEF序列构建的系统进化树注：“()”中为对应菌株的Genbank登记号，分支点的数字表示bootstrap支持率。Fig3-7PhylogenetictreebasedonTEFsequencesNote：Thecontentsin“()”representthesequenceaccessionnumberinGenBank．Thenumbersbesideeachbranchpointsrepresentthepercentagessupportedbybootstrap． 广西大学硕士学位论文水稻穗腐病镰刀菌及相关-tlt-素研究将供试菌株的TEF序列通过BLAST与Genbank中己登录的序列进行同源性比较。结果发现GZl、GZ2、GZ3与禾谷镰刀菌禾谷镰刀菌(Fgraminearum，登录号：JF747146)的同源性达到99％；F01、F02、F03等与尖孢镰刀菌(Foxysporum，登录号：JQ965449)的同源性达到99％；FPl、FP2、FP3等与层出镰刀菌(FProliferatum，登录号：JQ639205)的同源性达到99％；GFl、GF2、GF3等与藤仓镰刀菌(Ffujikuroi，登录号：JF699611)的同源性达到99％；GMl、GM2、GM3等与拟轮枝镰刀菌(Fverticillioidess，登录号：JQ639208)的同源性达到99％。通过MEGA4．0系统对供试菌株和Genbank中己登录菌株的TEF序列进行bootstrap聚类分析(图3．7)。GZl、GZ2、GZ33个菌株，F01、F02、F033个菌株，FPI、FP2、FP33个菌株，GFl、GF2、GF33个菌株和GMl、GM2、GM33个菌株bootstrap水平各自相聚于同一群。因此将GZl、GZ2、GZ3鉴定为禾谷镰刀菌(Fgraminearum)，有性阶段为玉蜀黍赤霉菌(Gzeae)；将F01、F02、F03等鉴定为尖孢镰刀菌(Foxysporum)；将FPI、FP2、FP3等鉴定为层出镰刀菌(Fproliferatum)；将GFl、GF2、GF3等鉴定为藤仓镰刀菌(Efujikuroi)，有性阶段为藤仓赤霉菌(Gfujikuroi)：将GMl、GM2、GM3等鉴定为拟轮枝镰刀菌(Everticillioidess)，有性阶段为串珠赤霉菌(Gmonilifc}rme)。216株镰刀菌菌株中，层出镰刀菌(Fproliferatum)为优势种，有137株，约占63．4％；藤仓镰刀菌(Ffujikuroi)为次优势种，有50株，约占23．1％；拟轮枝镰刀菌(Fverticillioidess)、尖孢镰刀菌(Foxysporum)和禾谷镰刀菌禾谷镰刀菌(Egraminearum)为弱势种，分别有2l株、5株和3株，约占9．7％、2．3％和1．4％。3．3病原镰刀菌的生物学特性3．3．1温度对病原镰刀菌生长的影响禾谷镰刀菌(Fgraminearum)在5-40。C的温度范围以内都可以生长，适宜的生长温度为15-35。C，最适生长温度是25。C，大于40。C或小于5"C菌丝停止生长，25。C下培养5d菌落直径可达7．26cm(图3．8)。尖孢镰刀菌(Foxysporum)在5．40。C的温度范围以内都可以生长，适宜的生长温度为20．35。C，最适生长温度是25。C，大于40。C或小于5℃菌丝停止生长，25。C下培养5d菌落直径可达7．61cm(图3-9)。24 广西大掌硕士学位论文水稻穗腐病镰刀菌及相关．毒素研究^暑V蹬毪瓣壤5℃10℃15℃20℃25℃30℃35℃40℃温度(℃)Temperature图3．8温度对禾谷镰刀菌生长的影响注：柱状图上小写字母表示经方差分析Duncan’S新复极差法，在P<0．05水平下的差异显著性和极显著差异。Fig．3-8EffectoftemperatureonmyceliumgrowthofEgraminearumNote：columnswithdifferentlowercaselettersshowthedifferentiaatP<0．05byDuncan’SMultiple—RangetestofAnalysisofVariance．95℃10℃15℃20℃25℃30℃35℃40℃温度(℃)Temperature图3-9温度对尖孢镰刀菌生长的影响注：柱状图上小写字母表示经方差分析Duncan’S新复极差法，在P<0．05水平下的差异显著性和极显著差异。Fig．3-9EffectoftemperatureonmyceliumgrowthofEoxysporumNote：columnswithdifferentlowercaselettersshowthedifferentiaatP<0．05byDuncan’sMultiple-RangetestofAnalysisofVariance．9876S4321O8765432lO-口-∞暑一葛争—5—8^暑v鼯整漆涟 广西大学硕士学位论文水稻穗腐病镰刀菌及相关毒素研究层出镰刀菌(Fproliferatum)在5-40*C的温度范围内都可以生长，适宜的生长温度为20．35*C，最适生长温度是25*C，大于40。C或小于5。C菌丝停止生长，25'C下培养5d菌落直径可达7．77cm(图3．10)。藤仓镰刀菌(Ffujikuroi)在5-40。C的温度范围内都可以生长，适宜的生长温度为20．35。C，最适生长温度是25。C，大于40。C或小于5。C菌丝停止生长，25。C下培养5d菌落直径可达8．14cm(图3．11)。拟轮枝镰刀菌(Fverticillioidess)在5-40。C的温度范围内都可以生长，适宜的生长温度为15-35*C，最适生长温度是25。C，大于40。C或小于5℃菌丝停止生长，25。C下培养5d菌落直径可达7．29cm(图3—12)。^E0《毪漆遴aS℃10℃15℃20℃25℃30℃35℃40℃温度(℃)Temperature图3．10温度对层出镰刀菌生长的影响注：柱状图上小写字母表示经方差分析Duncan’s新复极差法，在P