黄海海泥和庐山土壤样品中放线菌的分离、活性及生物多样性研究

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1、学校代码：10264研究生学号：M110208436上海海洋大学硕士学位论文黄海海泥和庐山土壤样品中放线菌的分离、活题目：性及生物多样性研究Isolation,BioactiveMetabolitesandBiodiversity英文题目：ofculturableActinomycetesfromTheYellowSeasedimentandLushansoilsamples专业：食品科学与工程研究方向：海洋生物资源利用与药理学姓名：王燕萍指导教师：杨靖亚二O一四年四月十六日万方数据上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明

2、：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分

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4、放线菌是一类高GC含量的革兰氏阳性菌，它在自然界分布广泛，在医药工业上具有重大的应用价值，为人类公共健康做出重大贡献。本研究首先采用传统分离方法分别从海泥和庐山样品中分离得到235株和197株放线菌，经过形态重排，从海泥样品中选出133株和庐山样品中选出52株形态不同的菌株。通过进一步的分子生物学鉴定，海泥中的133株放线菌分别属于4个不同的属，而庐山样品的52株分别属于8个不同的属。对这185株放线菌进行培养，取发酵液分别对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母进行生物活性检测发现，有18.4%的菌株对大肠杆菌有抑菌活性，8.1

5、%的菌株对枯草芽孢杆菌有抑菌活性，仅有2.1%的菌株对酿酒酵母有抑菌活性。其次，本实验使用新的分离技术扩散室法对样品进行分离。目前传统分离方法只能分离到0.1%-1%的微生物，尚有99%的微生物难培养。造成这种结果的重要原因是传统分离方法无法完全模仿自然界中微生物的生长环境。相比传统的平板分离法，采用扩散室法能较好地模拟自然界环境，可分离更多样的微生物。本研究通过膜材质，琼脂浓度，观察方式等实验确定扩散室法分离的较优条件。采用此条件对样品进行分离，成功分离得到放线菌。结果表明扩散室法可以有效分离得到放线菌，为后续分离更多样的

6、放线菌奠定基础。为进一步考察海泥和庐山样品的放线菌多样性，采用原位分析法对其进行研究，即先分别提取2个样品中的总DNA（宏基因组），然后用特异性引物直接PCR扩增放线菌的序列。以Identity≥99%作为同一基因类型的标准。从海泥中挑取27个克隆，检测到4种类型，包括通过传统分离法分离得到的Actionbacteria，其余种类如Gemmatimonadetes、Nitrospina、planctomycete和一些未培养的细菌，通过原位分析法才发现。从庐山土壤中挑取31个克隆，检测到10种类型，包括传统I万方数据上海海洋

7、大学硕士学位论文分离得到的Actionbacteria以及Thermomonosporaceaebacterium、Acidimicrobiaceae、Aciditerrimonas和一些未培养的细菌。实验结果表明，采用原位分析法可发现微生物的种类更为丰富，但并不能包含传统分离法所分离的所有类群，因此，将上述两种方法相结合将更为客观全面的反映样品中放线菌多样性。最后，采用抗性筛选和基因探矿技术，对海泥和庐山样品使用万古霉素为抗性筛选标记进行菌株筛选；通过万古霉素筛选出来的菌株共有35株，其中31株来源于庐山土壤样品。以糖肽类

8、化合物合成途径中的关键基因（vanHAX,oxyB,hall,oxyC和dpgC）的保守区为探针，从中筛选PCR阳性菌株。实验结果表明，有8个菌株含有vanHAX抗性基因，有17个菌株含有全部关键基因。关键词：放线菌；生物活性；扩散室；原位分析；糖肽类化合物II万方数据上海海洋大学硕士学位